顶空固相微萃取-气质联用法测定不同时期石虎果实中的挥发性成分

张誉湘，郑雪源#，张睿胤，郑亚杰,，陈淼芬，周昊倚，陆英，彭志雄，袁建华，文令，钟晓红*，唐其,*

（1.湖南农业大学园艺学院，湖南 长沙 410128；2.国家中药材生产（湖南）技术中心，湖南 长沙 410128；3.广西柳城鑫茂种养专业合作社，广西 柳城 545201；4.长沙和茂农业开发有限公司，湖南 宁乡 410609）

芸香科植物石虎Evodia rutaecarpa（Juss） Benth var.officinalis（Dode） Huang的干燥近成熟果实是药材吴茱萸（Euodiae Fructus）的3种来源之一。吴茱萸为中国大宗传统常用中药，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻之功效[1]。据报道[2]，各产地吴茱萸的采收时间各有不同。目前对吴茱萸挥发性成分的检测主要通过水蒸气蒸馏提取[3]，且对其本源挥发性成分的研究较少。本研究中，采集了6个时期（7 月中旬、7月下旬、8 月中旬、9 月上旬、9 月下旬、10 月中旬） 的石虎果实，采用顶空固相微萃取-气质联用技术（HS-SPME-GC-MS） 对不同时期石虎果实中的挥发性成分进行检测与解析，分析其变化趋势，旨在进一步了解和利用其挥发性成分，明确湖南石虎的最佳采收期。

1 材料与方法

1.1 材料

2018 年7 月 17 日、7 月 31 日、8 月14 日、9 月 1 日、9 月 29 日、10 月 24 日于湖南农业大学国家中药材生产（湖南）技术中心试验基地采集了扦插于同一母本的3 株石虎果实，经50 ℃干燥2 d，备用。

1.2 主要仪器与装置

MODULYOD-230 冷冻干燥机，赛默飞世尔科技有限公司出品；GCMS-QP2010 型气相色谱-质谱联用仪（包括 GC/MS solution 色谱工作站和NIST.14、NIST.17 质谱数据库），日本岛津公司出品；固相微萃取装置、固相微萃取进样手柄、萃取纤维头（85 μm PA），上海安谱实验科技有限公司出产。

1.3 样品预处理

将同一时期采集的样品混合冷冻干燥至恒重，使用球磨仪打粉并过筛（孔径25.4 mm）。取约 0.1 g样品，放置在顶空样品瓶中，备用。

1.4 萃取纤维针头老化

设定气化室温度为240 ℃，将萃取纤维针头插入气相色谱仪的气化室，老化40 min 后取出。

1.5 萃取与解吸附

固相微萃取装置的温度设为70 ℃，顶空瓶置于样品槽内预热 40 min 后，将萃取进样手柄插入顶空样品瓶中，萃取40 min。进样口温度设为 240 ℃，将萃取完成后的萃取进样手柄插入气相色谱仪进样口中，解析 5 min。

1.6 GC-MS 条件

采用CD-WAX 色谱柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm），柱内温度 60 ℃，进样口温度 240 ℃；进样方式为无分流，载气气体流速 0.98 mL/min；离子源为EI 源，离子源温度为 200 ℃，接口温度为 220℃，电子能量为 70 eV，质荷比扫描范围为 45～500 m/z。气相色谱仪升温条件：初始温度为60 ℃，保持 2 min；以 3 ℃/min升至 100 ℃，保持5 min；再以 3 ℃/min升至 190 ℃，保持 5 min；最后以 10℃/ min 升至 220 ℃，保持 5 min。MS 采集时间为70 min。

1.7 挥发性成分的检测与定性

利用 GC/MS solution 中的 NIST.14、NIST.17标准谱库检索色谱图中可能存在的化合物，并结合文献资料进行定性分析，推测化合物的结构。采用峰面积归一化法计算各成分的相对含量。

1.8 数据分析与统计

采用 Microsoft Excel 2019 进行数据整理与统计；运用 Origin 2018 绘图。

2 结果与分析

2.1 挥发性成分解析

石虎果实中的挥发性成分总离子流图如图 1所示。6 个时期的石虎果实中共鉴定出 72 种挥发性成分（表 1），其中，共有成分有 47 种。72 种成分中包含醇类（26.39%）、芳香烃类（1.39%）、烯烃类（29.17%）、酮类（11.11%）、吡唑类（1.39%）、醛类（4.17%）、酯类（12.50%）、醚类（11.11%）和酚类（2.77%）共9 种化合物，其中萜类化合物占比51.39%，包括单萜类化合物（36.11%）和倍半萜类化合物（15.28%）。6 个时期石虎果实的主要挥发性成分为顺式-β-罗勒烯、β-月桂烯和β-水芹烯，平均含量占比均超过10%。

图1 石虎果实挥发性成分总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components of the fruits of Evodia rutaecarpa

表1 不同时期石虎果实的挥发性成分Table 1 The volatile components of the fruits of Evodia rutaecarpa in different periods

表1(续)

2.2 萜类化合物的含量变化

6 个时期石虎果实中的关键挥发性成分的含量变化如图 2、图3 所示。从图2 可知，72 种化合物中萜类化合物的含量占比均超过80%，可见萜类化合物是石虎果实中的主要挥发性成分。从图3-a可以看出，单萜类化合物的占比在8 月中旬最高，6 个时期的含量差异不大。单萜类成分的主要化合物为顺式-β-罗勒烯，β-月桂烯和β-水芹烯；β-月桂烯的含量变化最大，其含量变化达9.53%；顺式-β-罗勒烯的含量在7 月最高，8 月中旬时含量占比减少，9 月上旬含量占比增大，而后2 个时期持续减少；这3 种化合物含量占比的总和在8 月中旬最高（55.9%）。从图3-b 可以看出，倍半萜类化合物的含量占比在9 月上旬时最高。β-榄香烯、右旋大根香叶烯和α-瑟琳烯为主要的倍半萜类成分，β-榄香烯的含量占比在7 月中旬最高，右旋大根香叶烯和瑟琳烯在9 月上旬达到最高值。

图2 不同时期石虎果实中萜类成分的含量Fig.2 Contents of terpenoids of the fruits of Evodia rutaecarpa in different periods

图 3 不同时期石虎果实中关键挥发性成分的含量Fig.3 The key volatile components of the fruits of Evodia rutaecarpa in different periods

3 结论与讨论

顶空固相微萃取-气质联用技术操作便捷、灵敏度高，大大缩短了试验时长，且无需溶剂提取，能对样品中本源挥发性成分进行分析。目前，应用HS-SPME-GC-MS 技术对石虎中挥发性成分的研究较少。本研究中，采用HS-SPME-GC-MS 技术测定了石虎果实中的挥发性成分，发现其中含有大量顺式-β-罗勒烯、β-月桂烯、β-水芹烯，与LIU 等[3]的研究结果基本一致。但LIU 等[3]研究发现，8 月湖南石虎果实的挥发油中β-月桂烯的含量是顺式-β-罗勒烯的2 倍，而本研究发现，8—10 月，顺式-β-罗勒烯在石虎果实挥发性成分中的占比均较高，推测可能是由于水蒸气蒸馏法和顶空固相微萃取法对挥发性成分的提取侧重点不同所致。杨占南等[4]应用 HS-SPME-GC-MS 技术检测疏毛吴茱萸中的挥发性成分，共鉴定出77 种化合物，其中主要为右旋大根香叶烯、顺式-β-罗勒烯、β-榄香烯和石竹烯。本研究中，右旋大根香叶烯的平均含量占比只有3.62%，石竹烯含量不足1%，推测这种差别可能是由于品种和产地不同所致。

本研究中，石虎果实挥发性成分中含有大量单萜类化合物和倍半萜类化合物，其中，榄香烯可用于多种癌症的治疗[5]，月桂烯可用于肾脏炎症的治疗[6]，罗勒烯可开发成抗高温试剂[7]，水芹烯可作为天然的杀虫剂[8]，芳樟醇在食品、日化等领域常被用作天然的食品添加剂与赋香剂[9]，表明石虎果实具有较高的综合利用价值。

吴茱萸的最佳采收期受品种和产地的影响[10]。本研究结果表明，石虎果实中的挥发性成分主要为顺式-β-罗勒烯、β-月桂烯和β-水芹烯，这3 种化合物含量的占比总和在8 月中旬最高，可为湖南石虎最佳采收期的判断提供参考。