60Co-γ射线辐照灭菌对白芍药材中有效成分的影响

崔永伟

（南京市溧水区中医院 药剂科，江苏 南京 211200）

白芍药材来源于毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，具有抗炎、镇痛、保肝、抗抑郁、调节免疫等药理作用[1-3]，主要含单萜及其苷类、黄酮类、三萜及其苷类、鞣质类等成分，如没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖（β-PGG）和苯甲酰芍药苷等化合物，白芍药材在煎煮、干燥、炮制等过程中，其有效成分易收到外界条件的影响而发生改变[4-8]。

中药材一般来源于植物、动物和矿物质等，其本身常带有微生物，加工炮制过程中也会引入微生物。部分微生物生长繁殖对中药材质量有一定影响，甚至危及患者健康和生命安全，因此，出厂前对中药材进行灭菌处理及控制具有十分重要的意义。目前，中药材的灭菌方法主要有乙醇蒸汽灭菌法、干热灭菌法、湿热灭菌法、环氧乙烷灭菌法、微波灭菌法、60Co-γ射线辐照灭菌等，部分药材在灭菌过程中药材质量会有不同程度改变[9-10]。

60Co-γ射线辐照灭菌具有杀虫灭菌、抑制发芽、保鲜等作用，其穿透力强、环保、高效，对中药材性状及质量影响甚微[11]，是目前中药材灭菌的最有效方式之一[12-13]。高剂量及高频次60Co-γ射线辐照灭菌对中药材中有效成分的含量有一定影响，因此辐照灭菌前应开展安全性、有效性和稳定性等方面验证工作[14-15]，确保药材在辐照灭菌过程中质量的稳定性。

本研究采用0，2，5，8 kGy剂量60Co-γ射线，对6批白芍药材进行辐照灭菌处理，考察6种有效成分，即儿茶素、没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、β-PGG、苯甲酰芍药苷的含量变化规律，旨在验证白芍药材辐照灭菌的可行性，为白芍药材开展低剂量60Co-γ射线辐照灭菌提供参考依据

1 仪器和材料

2695型高效液相色谱仪（2996DAD检测器，美国沃特世公司）；FW200万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）；AL104型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250A 型超声波清洗器( 北京科伟永兴仪器有限公司)；YJ-875 型医用净化工作台（苏州净化设备厂）。

芍药药材自采（见表1），经本人鉴定为毛莨科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的去皮干燥根。世界卫生组织规定食品辐射灭菌剂量≤10，本研究采用的辐照剂量为0，2，5，8 kGy。没食子酸对照品（批号：110831-201906，纯度：91.5 %）、芍药苷对照品（批号：110736-201943，纯度95.1 %）、儿茶素对照品（批号：110877-201604，纯度：99.2 %）、均购自中国食品药品检定研究院，芍药内酯苷对照品（批号：A25D8H50784，纯度≥91.4 %）、苯甲酰芍药苷对照品（批号：MUST-19022310，纯度≥98.0 %）购自上海源叶生物科技有限公司；β-PGG对照品（批号：P29F7F10218，纯度≥99.0 %）购自上海源叶生物科技有限公司。甲醇、乙腈均为色谱纯（美国JT.Baker公司），其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

表1 白芍药材信息表

2 方法与结果

2.1 色谱条件[16]

色谱柱：Tnertsil®ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.05 %磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～22 min，5 %→15 % A；22～40min，15 % A→38 % A；40～55 min,38 %→50 % A；60～65 min，50 % A；65～65 min，50 % A→5 % A）；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 取儿茶素、没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、β-PGG、苯甲酰芍药苷对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml分别含儿茶素0.256 mg、没食子0.355 mg、芍药内酯苷1.700 mg、芍药苷8.880 mg、β-PGG 1.160 mg、苯甲酰芍药苷0.240 mg的混合对照品贮备液；精密量取贮备液5 ml，置入25 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，混匀，滤过（0.22 μm微孔滤膜），取续滤液，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取新鲜采集白芍药材，洗净，除去头尾和细根，置沸水中煮后除去外皮，晒干，粉碎过筛（四号筛），取药材粉末约0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加稀乙醇50 ml，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz)45 min，放至室温，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过（0.22 μm微孔滤膜），取续滤液，即得供试品溶液。

图1 白芍高效液相色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密量取2.2.1项下混合对照品贮备液0.2，0.4，0.8，1，2，2.4，5.0 μl，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图峰面积，以峰面积（Y）对化合物质量浓度（X，mg/ml）进行线性回归，绘制标准曲线，计算线性范围。结果回归方程分别为儿茶素Y=1235.32X+15.32（r=0.9991）、没食子酸Y=7968.02X+3.70（r=0.9993）、芍药内酯苷Y=12 031.46X-20.45（r=0.9998）、芍药苷Y=223 462.12X-14.03（r=0.9998）、β-PGG Y=15 312.14X-26.31（r=0.9994）、苯甲酰芍药苷Y=15363.12X-18.95（r=0.9990），组分儿茶素、没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、β-PGG和苯甲酰芍药苷分别在0.005～0.128，0.007～0.178 ，0.034～0.850，0.178～4.440，0.023～0.580，0.005～0.120 mg/ml范围内呈良好的线性关系。

2.3.2 精密度试验 取2.2.1项下混合对照品溶液，按2.1项色谱条件，连续进样6次，记录色谱图峰面积，测得儿茶素、没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、β-PGG和苯甲酰芍药苷峰面积RSD分别为0.15 %，0.20 %，0.05 %，0.02 %，0.08 %和0.25 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批（编号：A2，0 kGy）白芍药材，按2.2.2项方法，平行制备供试品溶液6份，按2.1项色谱条件测定，记录色谱图峰面积，计算各组分含量及RSD。结果儿茶素、没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、β-PGG和苯甲酰芍药苷平均含量分别为1.235，1.51，7.122，33.326，4.610，0.678 mg/g，RSD分别为0.45 %，0.40 %，0.22 %，0.10 %，0.32 %和0.78 % （n=6），表明方法重复性较好。

2.3.4 稳定性试验 取同一批（编号：A2，0 kGy）白芍供试品溶液，分别于0，3，6，9，12，18，24 h进样，按2.1项色谱条件测定，记录色谱图峰面积。结果儿茶素、没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、β-PGG和苯甲酰芍药苷面积RSD分别为1.12 %，0.98 %，0.69 %，0.84 %，0.98 %和1.36 %（n=7），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.5 加样回收率试验 取同一批白芍药材（编号：A2，0 kGy）6份,洗净，除去头尾和细根，置沸水中煮后除去外皮，晒干，粉碎过筛（四号筛），精密称取粉末约0.075 g，置具塞锥形瓶中，加入2.2项下混合对照品贮备液2 ml，按2.2.2项方法制备供试品溶液，在2.1项色谱条件下进行测定，记录色谱图峰面积，计算白芍药材加样回收率，结果见表2。

表2 白芍药材6个成分加样回收率试验结果（n=6）

2.4 白芍样品测定

取经0，2，5，8 kGy60Co-γ射线辐照处理的白芍样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图峰面积，代入2.4.1项下各组分曲线方程计算6批样品含量。采用SPSS 22软件对辐照前后各组分含量进行配对t检验，考察60Co-γ射线辐照灭菌对白芍药材中有效成分的影响，并绘制不同辐照剂量各组分含量折线图。结果见表3、图2。

图2 60Co-γ射线对白芍药材有效成分含量影响的折线图

表3 白芍各成分含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

利用仪器自带DAD检测器功能，分别对儿茶素、没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、β-PGG和苯甲酰芍药苷的光谱图进行分析，结果表明，6成分在230 nm处吸收值均较大，可设定检测波长为230 nm。先后考察乙腈-0.1 %冰醋酸水溶液、乙腈-0.1 mol/L磷酸盐缓冲液和乙腈-0.05 %磷酸水溶液4种流动相系统，结果表明，以乙腈-0.05 %磷酸水溶液作为流动相时，供试品色谱图中6个主成分均能实现较好的分离效果，色谱峰对称性好，理论塔板数按儿茶素、没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、β-PGG和苯甲酰芍药苷计均大于6000。在2.1项色谱条件下，分别采用Boston C18、Tnertsil®ODS-2、Phenomenex Kinetex C18及Caprisil C18-AQ 4种品牌色谱柱进行测试，结果以Tnertsil®ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱的分离效果最佳。

3.2 灭菌效果检查

取经60Co-γ射线辐照灭菌的A1～A6样品，按中国药典2020年版四部（1105）非无菌产品微生物限度微生物计数法检查[17]，结果见表4。结果，经5，8 kGy辐照灭菌样品符合中国药典直接口服及泡服饮片要求，即需氧菌不得过105cfu/g，霉菌和酵母菌总数不多过103cfu/g，表明60Co-γ射线辐照灭菌对白芍药材灭菌效果较好。

表4 白芍药材微生物限度检查结果

3.3 不同辐照剂量对白芍质量影响

由表3可见，经成组配对t检验，6批样品中有效成分含量随60Co-γ射线辐照灭菌剂量变化而存在差异，当辐照剂量大于5 kGy时，与辐照前样品相比，辐照后样品中儿茶素、没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、β-PGG和苯甲酰芍药苷含量存在显著性差异（P＜0.05），即白芍样品质量发生了改变。所以，为保证白芍药材品质，60Co-γ射线辐照灭菌剂量最大设置为5 kGy较宜。由图2可见，6批白芍药材中儿茶素、没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、β-PGG和苯甲酰芍药苷的含量随辐照剂量提高而呈现下降趋势，且当辐照剂量大于5 kGy时，折线下降趋势最明显，6种成分中，以芍药苷折线较为平缓，表明，芍药苷较其它成分受60Co-γ射线影响较小。研究表明[6-8]，儿茶素、没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、β-PGG和苯甲酰芍药苷等成分在光照、高温、高湿等条件下含量有不同程度改变，而60Co-γ射线辐照灭菌方法是一种环保型灭菌方法，其灭菌彻底，不存在热对流和气体扩散等问题，且在常温下即可进行，有利于灭菌过程中样品质量的稳定性。

通过对不同剂量下60Co-γ射线辐照灭菌后白芍样品中6个有效成分含量的研究表明，当辐照剂不超过5 kGy时，6批白芍药材中儿茶素、没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、β-PGG和苯甲酰芍药苷含量稳定，且灭菌效果显著，所以，60Co-γ射线辐照灭菌方法适合白芍药材的灭菌，可为白芍药材贮存及流通提供强有力保障。