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修饰β-环糊精与非瑟酮包合物的制备及其抗氧化活性研究*

2022-03-08盘振杰杨敏芬黄秋萍张贞发

云南化工 2022年1期
关键词:自由基抗氧化活性

盘振杰,杨敏芬,黄秋萍,张贞发,王 强

(广西民族师范学院化学与生物工程学院,广西 崇左 532200)

非瑟酮,又名漆黄素,化学名为3,3′,4′,5,7-五羟基黄酮,能溶于酒精、丙酮、醋酸、烧碱溶液[1],有广泛的药理作用,具有抗肿瘤、抗氧化、抗感染等多种活性[2-3]。当代药理学研究证实,非瑟酮抗肿瘤作用显著,其主要是通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞迁移与侵袭等多种途径发挥抗肿瘤作用[4]。β-环糊精(β-CD) 是由7个D-吡喃葡萄糖单元通过α-1,4糖苷键连接而成的环状低聚糖化合物,分子形状略呈锥形,锥腔外存在大量基而呈亲水性,锥腔内呈疏水性[5]。正是β-CD这类疏水的空腔,允许辨别很多含有疏水基团的化合物,并与其形成主客体包合物的特殊结构与性质,在许多领域具有广泛的应用。药物通过与环糊精形成包合物,可以提高其稳定性和溶解性,以增强其生物利用度。本实验用β-CD与顺丁烯二酸及N,N′-二(3-氨丙基)乙二胺制备环糊精衍生物,并研究其水溶性、结合常数,以及抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

傅立叶红外变换光谱仪(美国Perkin Elmer公司);UV-8000紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司);DZF-6020真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司);AR224CN电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)。β-CD(生化试剂,BR级)、顺丁烯二酸酐、氯化亚砜、N,N′-双(3-氨丙基)乙二胺、非瑟酮、氢氧化钠、丙酮、无水乙醇、三乙胺、DMF,均为分析纯。

1.2 主体的合成

将 12 gβ-CD、30 mL DMF、3 mL 三乙胺置于三颈烧瓶中,反应温度 80 ℃。在此温度下,缓慢滴加 2 g 顺丁烯二酸酐 10 mL 溶液,搅拌反应 8 h,反应结束至冷却。将反应液慢滴到剧烈搅拌的丙酮中清洗,抽滤,最后在 50 ℃ 下干燥得到化合物B。产率约为72%。合成路线如图1。

图1 合成路线

将 6 gβ-CD顺丁烯二酸单酯粉末,溶于 12 mL DMF中,加入 15 mL 氯化亚砜,反应 2 h。滴加甲醇,除去多余的氯化亚砜,直至没有气泡冒出。加入 20 mL N′,N-二(3-氨丙基)乙二胺,在 80 ℃ 下反应 2 h。用丙酮洗涤,抽滤,在 50 ℃ 下干燥 1 d,得到主体C产物。合成路线见图1。

1.3 包合物的制备

用 6 mL 蒸馏水溶解 48.54 mg(约 0.035 mmol)的主体,缓慢滴加 20.00 mg(约 0.07 mmol)非瑟酮(用 9 mL 无水乙醇溶解),在 45 ℃ 下密闭反应 4 h。停止反应后冷却至室温,在真空干燥箱中 45 ℃ 干燥反应液,得到固体。固体用 2 mL 蒸馏水再次溶解至完全,用 0.45 μm 的纤维素膜过滤,溶液在 45 ℃ 下烘干,得到固体,即为主体-非瑟酮包合物。

1.4 主体与非瑟酮间结合稳定常数的测定

测定和计算主体与非瑟酮之间的结合稳定常数采用的是UV法。配制主体乙醇-水(V乙醇∶V水=3∶2)溶液浓度为5.0×10-4mol/L,备用。再配置上述浓度的非瑟酮溶液备用。取10个 5 mL 容量瓶,都加入 200 μL 非瑟酮溶液,每瓶分别加入主体溶液100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 μL,得到浓度梯度分别为1.0×10-5、2.0×10-5、3.0×10-5、4.0×10-5、5.0×10-5、6.0×10-5、7.0×10-5、8.0×10-5、9.0×10-5、10.0×10-5mol/L 的主体-非瑟酮乙醇溶液。然后采用UV测定上述溶液,波长为200~600 nm 范围,记录吸光度值(A)。

1.5 非瑟酮、主体及包合物的IR表征

在干燥的实验环境里,将烘干的KBr粉末分别与非瑟酮、主体及主体与非瑟酮的包合物混合均匀,并压成半透明的薄片,然后采用IR法在500~4000 cm-1内对非瑟酮、主体及包合物进行表征。

1.6 包合物抗氧化活性的测定

采用DPPH自由基清除法测定包合物的抗氧化活性。称取 3.9 mg DPPH自由基,用无水乙醇溶解,定容在 50 mL 容量瓶,得到浓度为2×10-4mol/L 的DPPH醇溶液,备用。称取 83.78 mg 包合物药品,用V无水乙醇∶V水=3∶2的混合溶剂溶解,定容在 50 mL 容量瓶,得到浓度为1.0×10-3mol/L 的包合物乙醇溶液。取5支 10 mL 容量瓶,配制一系列质量浓度梯度分别0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mg/mL 的包合物乙醇溶液。在测定吸光度之前,先用无水乙醇校正,并于λ=517 nm 处,测量A样品。随后,分别加入 2.5 mL 浓度为2×10-4mol/L 的DPPH自由基醇溶液,并尽量混合均匀,在黑暗条件放置 0.5 h。于λ=517 nm 处,测量A空白。最后把样品换为DPPH溶液,于λ=517 nm 处,测量A对照。重复上述从操作。

根据公式:K=[1-(A样品-A空白)/A对照]×100%,可计算出DPPH的自由基清除率。

2 结果与讨论

2.1 主体-非瑟酮的结合稳定常数分析

查阅文献可知,非瑟酮在λ=300~500 nm 范围里有紫外吸收,而主体在这波长范围里几乎无紫外吸收,因此该实验通过选择不改变非瑟酮的浓度而唯独改变主体的浓度来测量吸光度值(A)。如图2所示,随着主体浓度的增加,吸收峰强也随着增大,可能主体与非瑟酮发生反应,形成包合物。接着取λ=365 nm 处的吸光度值(A)建立工作曲线。由图2可知,曲线的线性关系良好。

图2 主体与非瑟酮结合稳定常数

由于主体与非瑟酮的包合比例是1∶1,所以主体与非瑟酮的反应过程满足下列计算公式:

式中:C1为主体的初始浓度;C2为客体非瑟酮的初始浓度,α为紫外可见光谱的敏感因子,ΔA为加入客体非瑟酮前后的相对吸强度。取横坐标为C1,纵坐标为C2C1/ΔA,绘制出线性拟合曲线。由图1可得知主体与客体非瑟酮的包合过程呈现出的线性关系不错。

最后依据拟合曲线的斜率与截距能够计算出主体与非瑟酮之间的结合稳定常数是:KS=2.1308×105。

2.2 红外光谱分析

图3为非瑟酮(a),主体(b),主体与非瑟酮包合物(c)的红外吸收光谱图。在3图中可见,a在 3487 cm-1有羟基伸缩振动、在 1649 cm-1有双键伸缩振动、在 1617 cm-1有羰基伸缩振动等;b在 2937 cm-1、2754 cm-1有氨基中等双峰的伸缩振动。根据图3可见,1645 cm-1左右的吸收峰加强,可能是包合物所形成的。同时,观察到主体与非瑟酮的包合物(c)的特征吸收峰与非瑟酮和主体的特征吸收峰大致相同,因此可得知包合物中和了非瑟酮和主体的吸收峰。正因为这三者所处的环境、吸收强度均不同,所以峰的强度有所不同。说明了非瑟酮和主体形成了包合物。

图3 红外光谱图

2.3 包合物抗氧化活性分析

研究清除自由基最常用的方法就是DPPH分析法。自由基DPPH稳定存在有机物溶液里,且于λ=517 nm 下具有较好的吸收强度。包合物的孤对电子可以与能够清除自由基的物质配对,这就导致在该波长下的吸收被削弱乃至消失。它的吸光度值的变化程度能够作为自由基清除率能力强弱的依据。如图4显示,该包合物的DPPH自由基的清除效果于0.25~1.25 mg/mL 范围内里随着质量浓度的增加而增大。由此看出该包合物具有较好的抗氧化能力。

图4 包合物的DPPH自由基清除活性

3 总结

本文通过水溶液法合成β-CD顺丁烯二酸单酯,再与氯化亚砜和N,N′-二(3-氨丙基)乙二胺反应,从而制得N,N′-二(3-氨丙基)乙二胺修饰β-CD(主体),然后用饱和水溶液法制备主体与非瑟酮(客体)的包合物。采用UV、IR等表征,并测定主体与客体的结合稳定常数为KS=2.1308×105。采用DPPH法测定包合物的抗氧化活性,结果表明,包合物对DPPH自由基具有较好的清除能力。

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