犏牛PPP1R11基因的克隆及在睾丸中的表达规律研究

2022-03-08闵星宇杨丽雪于海玲胡宇磊杨满珍杨璐瑜熊显荣

畜牧兽医学报 2022年2期

闵星宇，杨丽雪，于海玲，胡宇磊，杨满珍，杨璐瑜，李键,2，熊显荣,

(1.西南民族大学畜牧兽医学院，成都 610041； 2.青藏高原动物遗传育种资源保护与利用国家教育部重点实验室，成都 610041； 3.动物科学国家民委重点实验室，成都 610041)

犏牛为母牦牛(Bosgrunniens)与平原牛(Bostaurus)杂交得到的F1代，主要分布于我国青藏高原地区的优良家畜资源。牦牛生产性能低下，已无法满足青藏高原地区日益增长的奶肉需求，而平原牛又无法适应高原恶劣的高寒低氧环境。犏牛具有显著的杂种优势，产奶性能和产肉性能均优于牦牛，并有良好的高原适应性[1-3]。然而，雄性犏牛精子发生阻滞，使得无法通过横交固定其杂种优势，这严重制约了杂种优势的利用[4-5]。因此，开展犏牛繁殖生理的研究对提高青藏高原畜牧生产水平、改善牧民生活品质和发展青藏高原特色畜牧产业都具有重要的价值。

丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1(serine/threonine protein phosphatase，PP1)是一种去磷酸化酶，能够通过翻译后调控参与多种生物学过程[6-7]。在哺乳动物中共发现4种亚型，包括PP1α、PP1β、PP1γ1和PP1γ2，其中PP1γ2蛋白由蛋白磷酸酶1催化亚基γ(protein phosphatase 1 catalytic subunit gamma, PPP1CC)基因编码，主要富集于睾丸组织并参与精子细胞发生和成熟[8-9]，敲除PPP1CC基因造成雄性不育[10-11]。蛋白磷酸酶1调节亚基11(protein phosphatase 1 regulatory subunit 11，PPP1R11)最早通过酵母双杂交试验鉴定到是PP1的结合蛋白，又被称作INH3、TCTEX5、HCGV、IPP3，能够抑制PP1γ2的去磷酸化作用[12-13]。前期研究表明，PPP1R11基因是t-complex的重要组成部分，而t-complex 与精子活力受损和雄性不育有关[14]。Northern印迹杂交和免疫组织荧光染色显示，PPP1R11 mRNA和蛋白主要分布在小鼠睾丸组织中，其表达水平显著高于其他组织，在雄性不育小鼠中检测到PPP1R11基因的下调，推测该基因的下调导致生殖细胞的凋亡[13,15]。可见，PPP1R11基因在调控雄性配子发生和精子成熟中有重要作用。

目前，关于PPP1R11基因的研究主要集中在小鼠上，而在雄性不育犏牛上的研究还尚未报道。本研究以犏牛为研究对象，利用RT-PCR技术克隆获得犏牛PPP1R11编码区完整序列，并对该序列进行生物信息学分析，同时采用qRT-PCR和IHC染色检测该基因和蛋白在犏牛各组织及各发育阶段睾丸组织中的表达，以期为研究PPP1R11调控精子发生机制提供参考，为进一步从分子水平解析雄性犏牛不育机制奠定基础并提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与样品采集

将胎牛时期(5～6月龄)、幼年时期(1～2岁)、成年时期(3～4岁)犏牛作为本研究试验对象，样品采自成都市周边屠宰场。健康的犏牛屠宰后迅速采集睾丸、附睾、心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、肌肉和脂肪。以上所有样品每组各取3头为生物学重复，样品使用高压灭菌处理的生理盐水冲洗剪成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的组织块，一部分放入冻存管，置于液氮罐中带回实验室，于-80 ℃保存；另一部分使用4%多聚甲醛固定，用于IHC染色检测。

1.2 犏牛和牦牛组织总RNA的提取与反转录

冷冻的犏牛和牦牛各组织使用高通量组织研磨器研磨后，按照Trizol法，经离心、沉淀、清洗和溶解等步骤进行总RNA的提取，使用紫外分光光度计(Biospec-nano，日本)检测总RNA的浓度和纯度，选取OD260 nm/OD280 nm介于1.8～2.0的RNA，并经1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，置于-80 ℃保存备用。根据Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒(Thermo scientific，美国)说明书合成第一链cDNA，置于-20 ℃保存。

1.3 引物的设计与基因克隆

从NCBI数据库中选取野牦牛(Bosmutus)PPP1R11基因预测序列(登录号：XM_014483599.1)和β-actin基因序列(登录号：DQ838049.1)，使用Primer 5.0软件设计引物(表1)，并送至南京金斯瑞公司进行合成。以犏牛睾丸组织cDNA为模板，利用RT-PCR技术在PCR仪(Applied Biosystems，美国)扩增犏牛PPP1R11基因CDS区序列，PCR扩增体系为25 μL：12.5 μL 2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，1 μL cDNA模板，1 μL上、下游引物，ddH2O补足至25 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s， 72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃彻底延伸5 min，4 ℃保存。使用浓度为1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外光下切割回收目的产物进行纯化，交由上海生工生物工程股份有限公司(成都)测序。

1.4 PPP1R11基因的生物信息学分析

利用ORF Finder查找犏牛PPP1R11克隆序列开放阅读框并翻译成氨基酸序列。采用T-COFFEE在线软件并结合DNAMAN 9.0软件对不同物种PPP1R11的氨基酸序列同源性进行比较，通过MEME在线工具分析查找具有高度保守性的基序，并用MEGA 7.0软件构建系统发生树。利用ExPASy ProtParam、TMHMM、PSORTⅡ和SignalP在线软件进行犏牛PPP1R11蛋白基本理化性质、跨膜区、亚细胞定位和信号肽分析。糖基化位点和磷酸化位点预测使用NetPhos 3.1、NetOGlyc 4.0和NetNGlyc 1.0软件在线分析。该蛋白二级结构、三级结构和互作蛋白通过SOPMA、VMD 1.9.3和STRING 11.0预测。

1.5 犏牛PPP1R11基因的表达分析

以β-actin为内参基因，使用Bio-Rad实时荧光定量仪(美国)检测PPP1R11 mRNA在犏牛各组织(睾丸、附睾、心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、肌肉、脂肪)中的表达量并进行表达谱分析，及其在不同年龄组犏牛睾丸组织中的表达量。qRT-PCR反应体系如下：2×NovaStart SYBR qPCR Super Mix plus 10 μL，cDNA 1 μL,上、下游引物各0.5 μL，补充ddH2O至20 μL。PCR扩增条件如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环；熔解曲线为65～95 ℃每10 s增加0.5 ℃。

1.6 免疫组织化学染色

将不同时期睾丸组织从固定液中取出，制作石蜡切片。切片经二苯甲中脱蜡，酒精洗涤，EDTA抗原修复，PBS洗涤后，放入3%双氧水阻断内源性过氧化物酶；5%胎牛血清室温封闭30 min，滴加一抗(多克隆兔抗PPP1R11，1∶200稀释，博奥森)后4 ℃孵育过夜，阴性对照不加一抗；滴加二抗(多聚化山羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶标记)，室温孵育50 min；滴加DAB显色液显色，自来水冲洗切片终止显色；苏木精复染3 min左右，复染细胞核；中性树胶封片。使用激光共聚焦显微镜(Zeiss，德国)观察并拍照。

1.7 数据统计分析

应用2-ΔΔCt法分析qRT-PCR检测结果，结果使用“平均值±标准误(Mean ± SEM)”表示。使用SPSS 19.0软件的T-test检验进行数据分析，P<0.05代表差异显著，P<0.01代表差异极显著。

2 结果

2.1 犏牛PPP1R11基因克隆及生物信息学分析

2.1.1 犏牛PPP1R11克隆以犏牛睾丸组织cDNA为模板，F1、R1为上、下游引物，PCR扩增犏牛PPP1R11基因编码区序列，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测显示，目标条带与预期结果相符(图1A)。经测序得到893 bp的核苷酸序列，其中犏牛PPP1R11基因CDS为324 bp，共编码107个氨基酸(图1B)。

2.1.2 犏牛PPP1R11同源性比较与系统进化树对不同哺乳动物PPP1R11的氨基酸序列同源性分析发现，PPP1R11在不同哺乳动物中高度保守，其中犏牛与牦牛和黄牛同源性最高(100%)，其次为瘤牛(99.07%)、水牛(99.07%)、绵羊(99.07%)、山羊(99.07%)、羊驼(98.06%)、猪(97.09%)、马(97.09%)、大狐蝠(96.12%)、蓝鲸(95.28%)、港海豹(95.24%)、智人(95.15%)，与鸭嘴兽的同源性最低(84.88%)(图2A)。通过MEME软件在线分析获得PPP1R11蛋白最保守的2个基序(图2B)，分别位于犏牛PPP1R11氨基酸序列N端第6～55和58～107位点。基于15种哺乳动物PPP1R11不同氨基酸序列，采用邻接算法构建系统进化树(图3)，发现犏牛和黄牛聚为一支，在进化上与牦牛、瘤牛、水牛、绵羊和山羊亲缘关系较近，与非反刍类动物亲缘关系较远，这与同源性比较结果一致。

2.1.3 犏牛PPP1R11理化性质犏牛PPP1R11蛋白的分子量、理论等电点和分子式分别为12.014 ku、8.33和C503H803N163O164S8；氨基酸组成中，脯氨酸(Pro)占比最高，其含量为13.1%；带负电荷(Asp + Glu)和带正电荷(Arg + Lys)的氨基酸残基总数分别16和18个，表明该蛋白可能带正电。糖基化位点预测表明，犏牛PPP1R11蛋白含1个 N糖基化位点和18个O糖基化位点；磷酸化位点预测显示，该蛋白有19个磷酸化位点，其中丝氨酸(Ser)磷酸化位点11个，苏氨酸(Thr)磷酸化位点7个，酪氨酸(Tyr)磷酸化位点1个。该蛋白亚细胞定位主要存在于细胞核(47.8%)，其次为线粒体(34.8%)和细胞质(17.4%)；不含信号肽且无跨膜结构域。

2.1.4 犏牛PPP1R11结构与互作蛋白预测采用SOPMA预测PPP1R11蛋白的二级结构，其中18个氨基酸(16.82%)形成α螺旋，16个氨基酸(14.95%)形成延伸链，9个氨基酸(8.41%)形成β转角，64个氨基酸(59.81%)形成无规则卷曲(图4A)；通过VMD 1.9.3预测到犏牛PPP1R11蛋白三级结构(图4B)。采用STRING数据库分析犏牛PPP1R11潜在相互作用蛋白显示，PPP1R11可能与PPP1R2、PPP1R7、PPP1CA、PPP1CB、PPP1CC、PPA2、CIRH1A和UTP20等10个蛋白存在相互作用(图4C)。PPP1R11蛋白处于互作网络核心位置，且与PPP1R7、PPP1CB、PPP1R2、UTP20蛋白间的相互作用具有更高可信度。

A: M. DNA相对分子质量标准DL2000; 1. 犏牛PPP1R11基因扩增产物；B.犏牛PPP1R11基因核苷酸及其推测的氨基酸序列A: M. DL2000 marker; 1.PCR product of cattle-yak PPP1R11 gene；B. Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of cattle-yak PPP1R11图1 犏牛PPP1R11基因的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of cattle-yak PPP1R11 gene

2.2 犏牛PPP1R11基因的表达模式

2.2.1 犏牛PPP1R11组织表达谱以β-actin作为内参基因，利用qRT-PCR技术检测PPP1R11 mRNA在犏牛睾丸、附睾、心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、肌肉和脂肪组织中的表达量(图5)。结果显示，该基因在犏牛12个组织中均有表达，在睾丸、脾和胃组织中表达量较高，其在睾丸中的表达水平极显著高于其它各个组织(P<0.01)。

2.2.2 犏牛睾丸中PPP1R11的表达规律采用qRT-PCR检测PPP1R11 mRNA在犏牛不同发育时期睾丸组织中的相对表达水平(图6)。结果显示，该基因在犏牛睾丸组织中的表达随年龄的增加呈上升趋势；5～6月龄胎牛睾丸组织中几乎不表达，表达量低于同龄的牦牛，但差异不显著(P>0.05)；1～2岁和3～4岁犏牛睾丸中的表达水平极显著低于同时期牦牛(P<0.01)。

2.2.3 犏牛PPP1R11的细胞定位基于犏牛和牦牛PPP1R11 mRNA在睾丸中的表达差异极显著，本试验进一步通过免疫组织化学染色方法检测PPP1R11蛋白在犏牛和牦牛不同年龄段睾丸组织中的细胞定位和表达情况(图7)。结果显示，犏牛和牦牛5～6月龄胎牛睾丸组织生精小管形态无明显差异；1～2岁和3～4岁犏牛与牦牛睾丸组织中，犏牛生精小管管径缩小，空腔增大，生精上皮皱缩，细胞组成差异显著，仅有精原细胞、支持细胞和少量初级精母细胞(PS)松散分布，无次级精母细胞(SS)和精子细胞。IHC染色发现，PPP1R11蛋白在犏牛和牦牛各年龄段睾丸组织中均有表达。其中5～6月龄犏胎牛睾丸组织中，PPP1R11蛋白主要定位于精原干细胞(SSC)，支持细胞(SC)几乎不表达，与同时期牦牛具有相同的蛋白定位；1～2岁和3～4岁犏牛睾丸组织中，PPP1R11蛋白主要定位于初级精母细胞和间质细胞(IC)，精原细胞和支持细胞中蛋白阳性信号较弱，而牦牛各级生殖细胞、支持细胞和间质细胞中均检测到PPP1R11阳性信号。

A. 15种不同哺乳动物PPP1R11氨基酸序列的多重比较；B. PPP1R11氨基酸序列中2个最保守基序A. Multiple alignment of PPP1R11 amino acid sequences from 15 different mammalian species; B. Two of most conserved motifs in PPP1R11 amino acid sequence图2 不同哺乳动物PPP1R11氨基酸序列对比Fig.2 Alignment of amino acid sequence of PPP1R11 among different mammals

图3 PPP1R11蛋白氨基酸序列系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree for PPP1R11 amino acid sequences

A. 犏牛PPP1R11蛋白二级结构；B. 犏牛PPP1R11蛋白三级结构； C. 犏牛PPP1R11的蛋白互作网络A. Secondary structure of cattle-yak PPP1R11 protein; B. Tertiary structure of cattle-yak PPP1R11 protein; C. Interaction network for cattle-yak PPP1R11 protein图4 犏牛PPP1R11蛋白的空间结构及互作蛋白Fig.4 Spatial structure and interaction proteins of cattle-yak PPP1R11

3 讨论

雄性生殖力是种畜的重要评价指标，性状优良的种公畜往往能够产生更大的经济效益，故而提高种公畜生殖力对养殖业的发展具有促进作用。犏牛是牦牛和黄牛的杂交后代，具有杂种优势显著和雄性不育的特点[16]，其雄性不育犏牛可作为研究雄性生殖调控机理的天然理想模型。据报道，蛋白质磷酸化与去磷酸化参与了30%～70%的细胞信号转导过程[6]，精子发生是一个高度动态变化的复杂过程，需要多种磷酸化酶的参与[17]。其中，去磷酸化酶PP1γ2能够直接调控哺乳动物的精子发生，而PPP1R11能够通过抑制PP1γ2的表达来维持精子的正常发生和成熟[15,18]。因此，探索PPP1R11在睾丸中的表达规律对于研究生殖调控和解析犏牛雄性不育机制具有重要的价值。

本研究成功克隆了犏牛PPP1R11基因CDS区全长序列，由324 bp的核苷酸组成，编码107个氨基酸，这与NCBI中提供的野牦牛预测序列(XM_014483599.1)和已报道黄牛[19]的序列完全一致，该基因CDS区长度与瘤牛、水牛、山羊和绵羊一致。通过氨基酸序列对比发现，犏牛PPP1R11蛋白与其它14种哺乳动物同源性在95%以上(鸭嘴兽除外)，并识别到2个最为保守的基序。这些结果表明，犏牛PPP1R11与其它哺乳动物相比具有高度同源性和进化上的高度保守性，PPP1R11可能在不同物种中发挥较为一致的生物学功能。鉴于PPP1R11主要通过与相应蛋白互作发挥功能，本研究进一步分析了犏牛PPP1R11的互作蛋白发现，该蛋白与PPP1R2、PPP1CB等10个蛋白质分子存在相互作用。其中PPP1CA、PPP1CB、PPP1CC和PP2A互作为不同类型蛋白磷酸酶，被广泛报道能够参与调控哺乳动物睾丸发育、精子发生和成熟[20-23]。有研究表明，在小鼠原始生殖细胞中特异性敲除PP2A可导致雄性小鼠不育[24]，通过转录组测序技术检测到PP2A在雄性不育犏牛睾丸中也表现为下调[25]，此外PP2A还可以通过调控减数分裂来调节卵母细胞的成熟[26]。PPP1R2、PPP1R7和PPP1R11均为PP1的调节剂，能够在小鼠附睾中共同调控精子的成熟[15]，PPP1R11能够通过抑制PPP1R7与PP1结合从而确保有丝分裂过程中动粒与纺锤体的结合[27]，而PPP1R11与PPP1R2能否直接互作还未见报道。有研究表明，UTP20能激活RNA聚合酶Ⅰ转录并促进细胞增殖[28]，推测PPP1R11可能与UTP20互作从而参与调控细胞增殖。综上，这些潜在与犏牛PPP1R11互作的蛋白分子均在睾丸发育和精子发生中发挥了重要的作用，这为深入理解PPP1R11在哺乳动物睾丸发育及精子发生中的分子机制提供了思路和见解。

不同的字母表示差异极显著(P<0.01)。下同Different letters represent the significant differences(P<0.01). The same as below图5 PPP1R11 mRNA在犏牛中的组织表达谱Fig.5 Tissue expression profile of PPP1R11 mRNA in cattle-yak

图6 PPP1R11 mRNA在不同发育阶段犏牛睾丸中的表达规律Fig.6 Expression patterns of PPP1R11 mRNA in testes at different developmental stages of cattle-yak

A. 犏胎牛睾丸(5～6月龄)；B. 幼年犏牛睾丸(1～2岁)；C. 成年犏牛睾丸(3～4岁)；D. 牦胎牛睾丸(5～6月龄)；E. 幼年牦牛睾丸(1～2岁)；F. 成年牦牛睾丸(3～4岁)；G. 成年犏牛睾丸(阴性对照)；H. 成年牦牛睾丸(阴性对照)。SP. 精原细胞；PS. 初级精母细胞；SS. 次级精母细胞；SC. 支持细胞；IC. 间质细胞；RS. 圆形精子细胞；ES. 长形精子细胞A. Fetal cattle-yak testis (5-6 months); B. Juvenile cattle-yak testis (1-2 years old); C. Adult cattle-yak testis (3-4 years old); D. Fetal yak testis (5-6 months); E. Juvenile yak testis (1-2 years old); F. Adult yak testis (3-4 years old); G. Adult cattle-yak testis (Negative control); H. Adult yak testis (Negative control). SP. Spermatogonium; PS. Primary spermatocyte; SS. Secondary spermatocyte; SC. Sertoli cell; IC. Leydig cell; RS. Round spermatid; ES. Elongating spermatid图7 不同阶段雄性犏牛生殖细胞发育及PPP1R11蛋白定位Fig.7 The growth of male cattle-yak germ cells and location of PPP1R11 protein at different stages

通过qRT-PCR检测了PPP1R11基因在犏牛不同组织中的表达，组织表达谱分析显示，该基因在犏牛各组织中均有表达，在睾丸组织中表达最高，这与小鼠[29]、大鼠[30]和绵羊[31]PPP1R11基因组织表达谱相一致，PPP1R11基因在多种哺乳动物睾丸组织中的高表达表明该基因与雄性生殖相关，且在犏牛睾丸中也可能发挥了相似的功能。Goswami等[15]研究表明，PPP1R11基因在小鼠附睾中能够促进精子的成熟，而犏牛附睾中该基因表达水平较低，推测是因为犏牛精子发生阻滞，附睾中无精子细胞可成熟。此外，本试验还检测到该基因在脾和胃中有较高表达，推测该基因除参与睾丸发育、精子生成和成熟外，在其他组织中也可能发挥作用，其具体功能有待进一步研究。

本试验检测到PPP1R11在犏牛睾丸组织中的表达水平随睾丸生长发育呈上升趋势，与同时期牦牛相比均较低，且在幼年和成年时期差异极显著。有研究表明，过表达PPP1R11能够抑制细胞的凋亡[32]，在T-单倍型突变雄性不育小鼠模型中，PPP1R11也表现为下调[33]，由此推测PPP1R11在睾丸中的表达水平与雄性生殖力成正相关，而雄性犏牛不育也可能与此有关联。为进一步探讨PPP1R11基因在犏牛睾丸中发挥的作用，利用IHC染色检测PPP1R11蛋白在犏牛3个时期睾丸中的表达和细胞定位。成年期犏牛生精小管内只观察到精原细胞、支持细胞和少量初级精母细胞，未观察到次级精母细胞和精子细胞，说明雄性犏牛精子发生阻滞于初级精母细胞，这与前人研究结果一致[34-36]。在幼年期和成年期犏牛睾丸组织中，PPP1R11蛋白主要定位于犏牛初级精母细胞和间质细胞，其蛋白阳性信号强度显著低于同时期牦牛，这与qRT-PCR的结果一致。正常生殖力小鼠睾丸中，PPP1R11蛋白主要定位于圆形期精子和长形期精子，其他各级生殖细胞和支持细胞亦有表达[13-15]，正常生殖力牦牛生精小管中各级生殖细胞均检测到PPP1R11蛋白阳性信号，本试验中犏牛精原细胞几乎不表达PPP1R11蛋白，这与小鼠和牦牛的结果不一致，推测该蛋白在犏牛精原细胞中的下调导致初级精母细胞生成的减少，从而造成精子发生阻滞。综上，PPP1R11基因可能参与调控哺乳动物精子发生，其mRNA和蛋白在犏牛睾丸中的差异表达可能是造成雄性犏牛减数分裂阻滞的原因之一。