枣多糖对小鼠派氏结和肠系膜淋巴细胞增殖的影响研究

2022-03-07刘鹏马红梅郭超炫庞欣雨宋博文景潇颖潘嘉璐郝艳霜李树鹏赵国先

北方牧业 2022年23期

刘鹏，马红梅，郭超炫，庞欣雨，宋博文，景潇颖，潘嘉璐，郝艳霜，李树鹏★，赵国先★

（1.河北农业大学动物医学院，河北保定071001；2.河北农业大学动物科技学院，河北保定071001；3.西藏大学理学院，西藏拉萨850000）

枣是我国重要传统营养食品，因富含糖类、蛋白质、维生素等成分，也兼具药用价值。枣中多糖含量最为丰富，占干物质的60%～80%[1]，据报道将枣多糖添加到日粮中，可影响IgA 形成的过程进而有利于肠黏膜IgA 的大量生成，提高肠黏膜SIgA 的分泌量，进而缓解环磷酰胺对肠黏膜免疫屏障的损伤，并有效增强机体免疫[2]，但其通过何种途径激活机体免疫系统尚不明确。研究认为此类多糖分子进入小肠后，可以完整通过小肠特殊上皮细胞膜的内吞作用跨膜进入上皮细胞下的免疫组织，发挥免疫调节作用，如对派氏结中巨噬细胞的作用，进而引发肠黏膜免疫反应，并激活机体免疫系统[3,4]。因此，本研究通过体外培养小鼠派氏结和肠系膜淋巴细胞，观察枣多糖对其增殖率的影响，探讨枣多糖激活机体免疫机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料与动物

枣多糖：本实验室自制，从金丝小枣中提取、精制获得[5]，得到JP60、JP70、JP80、JP90 共4个组分。

6 周龄SPF 级昆明小鼠（NO.110），体重为（21±5）克，雌性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要试剂与仪器

95%乙醇、氯仿、正丁醇、D900 大孔阴离子吸附树脂、RPMI-1640 培养基、胎牛血清（FBS）、磷酸盐缓冲液（FBS）、LPS、台盼蓝、青／链霉素等均为常用试剂；DG-5032 型酶联免疫检测仪，南京华东电子集团医疗装备有限责任公司；二氧化碳培养箱，德国贺利氏；TD-4 台式低速离心机，湖南凯达科学仪器有限公司。

1.3 淋巴细胞的分离与鉴定

将脱颈处死小鼠于75%乙醇浸泡5～10 分钟，无菌剖开腹腔，取适量小肠派氏结和肠系膜淋巴结于培养皿中，去除脂肪和筋膜组织并用PBS冲洗；将选取组织剪成小块，注射器芯挤压，PBS冲洗并过200 目滤网，即得淋巴细胞混悬液。

淋巴细胞混悬液离心弃上清，加入3～5 倍细胞体积的红细胞裂解液作用1～2 分钟，离心2～3 次弃上清，以去除红细胞和裂解液；离心后淋巴细胞用RPMI-1640（含100 单位/毫升青链霉素和10%FBS）重悬，37℃、5% CO2培养箱中静置2 小时，收集未贴壁细胞即为淋巴细胞。

未贴壁细胞台盼蓝染色、计数，要求活细胞数达到90%以上；调整细胞浓度为5×104个／毫升，即为淋巴细胞悬液。

1.4 试验分组及给药

将制备的5×104个/毫升淋巴细胞悬液加入96 孔板，每孔85 微升，37℃、5%CO2培养箱中培养6～24 小时至细胞贴壁备用。

试验分对照组、25 微克/毫升JP60 组、50 微克/毫升JP60 组、100 微克/毫升JP60 组和150微克/毫升JP60 组，每个组4 个重复。将已贴壁好的淋巴细胞按照对照组加入15 微升超纯水，试验组分别加入10 微升不同浓度的JP60 以及5 微升20 微克/毫升的LPS，至多糖终浓度为150 微克/毫升、100 微克/毫升、50 微克/毫升、25微克/毫升、0 微克/毫升，LPS 终浓度为1 微克/毫升。

将处理好的96 孔板置于37℃、5%CO2培养箱，作用48 小时后取出并去上清，重新加入90微升RPMI-1640，每孔再加入10 微升MTT 溶液，37℃、5%CO2培养4 小时去上清，每孔加入110 微升Formazan 溶解液，置摇床上低速振荡10 分钟，490 纳米测OD 值。

JP70、JP80 和JP90 组分试验操作同上。

淋巴细胞相对增殖率=试验孔OD 值/对照孔OD 值。

组别对照组 25 微克/毫升+LPS 50 微克/毫升+LPS 100 微克/毫升+LPS 150 微克/毫升+LPS LPS JP60 0.95±0.02a 1.68±0.05c 2.06±0.06d 2.23±0.08e 2.55±0.11f 1.22±0.04b JP70 1.43±0.06c 1.75±0.06d 1.95±0.07de 2.08±0.08e JP80 1.45±0.05c 1.78±0.05d 2.05±0.08de 2.13±0.09e JP90 1.76±0.05c 2.25±0.06d 2.42±0.09e 2.62±0.12f

组别对照组 25 微克/毫升+LPS 50 微克/毫升+LPS 100 微克/毫升+LPS 150 微克/毫升+LPS LPS JP60 0.93±0.02a 1.63±0.04c 2.13±0.05d 2.35±0.09e 2.58±0.12f 1.18±0.03b JP70 1.40±0.05c 1.82±0.06d 1.09±0.08de 2.13±0.09e JP80 1.41±0.05c 1.86±0.06d 2.11±0.08de 2.19±0.09e JP90 1.71±0.04c 2.31±0.05d 2.45±0.08e 2.62±0.11f

1.5 数据处理

结果以 “均值±标准差” 表示，数据通过SPSS19.0 软件进行单因素方差分析， P＞0.05 表示差异不显著， P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

多糖对派氏结和肠系膜淋巴结淋巴细胞增殖的影响结果见表1 和2。表中各多糖组和LPS组派氏结和肠系膜淋巴结淋巴细胞与对照组比较，增殖率均有显著提高（p＜0.05），说明枣多糖和LPS 均能明显刺激淋巴细胞增殖，且JP60、JP70、JP80 和JP90 枣多糖混合LPS 促进淋巴细胞增殖作用均明显强于LPS（p＜0.05）。

另外，随着枣多糖剂量增加，各组淋巴细胞增殖率呈上升趋势，尤以JP60 和JP90 组效果更为显著（P＞0.05）。