百香果内生细菌多样性及促生长特性

唐嘉城 梁毅珉 马葭思 彭桂香 谭志远

（1.华南农业大学农学院，广州 510642；2.华南农业大学资源环境学院，广州 510642）

植物内生菌（endophyte）是指在健康植物的细胞间或细胞内存活且可在不同时期或不同组织间存在的各种微生物［1］。虽然进入植物体内的方法和时间不尽相同，但其一旦定植于植物体内的便可以与植物形成稳定地共生关系［2-3］。大部分植物体内均有植物内生菌存在，虽然其定植于植物体内的方式不尽相同，但是其在植物体内对寄主植物都具有多种作用，一些具有生防作用的有益内生细菌不仅能够起到与化学农药相似的作用，还能减少农药滥用对环境和人类健康的危害，在植物保护方面有很大的应用价值［4］。植物内生菌的研究与生物肥料及相关菌剂制造息息相关，通过生物肥料和菌剂改善土壤条件有利于农业生产可持续发展，并可改善长期施用化肥而带来的土壤酸化、重金属污染等负面影响。因此，了解百香果内生菌的种群特点和系统发育关系，并对其内生菌的生物学功能与促生特性进行研究，挖掘菌种资源，从而将其应用于农业生产，对农业可持续发展做出贡献。

百香果（Passiflora edulia Sims）属于西番莲科西番莲属，主要生长于热带和亚热带地区，常见品种有黄金、满天星等。在种植1到2年后开始结果，花期较长一年多季，可种植10年左右。百香果具有食用、药用和观赏等多种经济价值。果瓤内含大量汁液，加入糖和其他添加剂，可制成芳香可口的饮料，现多用于添加在各种饮品中以提供酸甜爽口的味觉体验和富含维生素C与多种微量元素的营养价值。百香果花的花瓣多且柱头有3个分裂水平分开，颜色多为白色和紫色，作为藤本植物可种植于庭园中以作观赏，具有很大的市场潜力。我们从百香果根茎叶中分离纯化内生细菌，并对其进行系统发育分析，之后进行生理生化试验和相关功能性试验以期望找到对植物生长具有促生作用，可在农业生产领域应用且具有多种促生特性于一体的微生物种质资源，从而更好地服务于农业生产。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 百香果（Passiflora edulia Sims）取自华南农业大学农场，选用百香果的根、茎、叶作为分离内生细菌的主要部位。

1.1.2 主要培养基 使用NFB无氮培养基［5］、DN无氮培养基［6］和LB培养基对百香果内生菌株分离纯化。PKO培养基、钾细菌筛选培养基和MSA-CAS培养基等［6］进行促生试验。

1.1.3 主要试剂和仪器 气象色谱仪，北京北分天普仪器技术有限公司；分光光度计，PCR仪、凝胶成像系统，Bio-Rad公司；3-吲哚乙酸，合肥博美生物公司；2×Taq PCR Mix、DNA Marker，北京擎科生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离纯化 参考谭志远等［7］的方法。将采集到的健康百香果植株用清水洗去表面灰尘和泥土，根、茎取2-3 cm左右的小段若干，叶取3 cm×3 cm左右的叶片若干放入灭过菌的培养皿内置于超净台中进行表面灭菌，先用75%的酒精浸泡植物组织块2-3 min，期间可用灭菌镊子晃动组织块使表面灭菌更充分，重复两次，之后用无菌水洗涤2-3 min，重复两次，将组织块用4%次氯酸钠浸泡4-7 min（根、茎浸泡时间偏长，叶浸泡时间偏短），之后再次用无菌水洗涤2-3 min，重复3次，保留最后一次洗涤的无菌水涂布在LB平板上作为对照，以确定植物组织块外表面是否消毒彻底。将表面消毒完成的根、茎用灭菌的剪刀剪去两端各约0.5 cm，保留1-2 cm的中间部分，同样对叶片组织周围减去约0.5 cm宽的叶片，保留2 cm×2 cm的中间部分，目的是将根、茎两端及叶片周围过度消毒的部分去除。之后将组织块放入灭好菌的研钵中，加入无菌水，用研磨棒充分研磨，吸取0.1 mL研磨液于1.5 mL EP管中，加入0.9 mL无菌水充分混匀，然后将其浓度梯度稀释为10-3、10-4、10-5，分别取50 μL稀释液用涂布平板法涂布于NFB、LB、DN固体培养基上，倒置装袋置于37℃恒温培养箱培养，24 h后观察培养基中菌落的生长情况，挑取生长状况良好的单菌落以平板划线法培养多代，直至获得表型特征一致的纯化菌株。

1.2.2 IS-PCR插入序列指纹图谱聚类 以各菌株的全基因组DNA为模板，通过指纹图谱（IS-PCR）方法［8］，使用通用引物J3进行PCR扩增，PCR反应体系（25 μL）：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，50 μmol/L J3 1.0 μL，模板 DNA（40 ng/μL）0.5 μL，ddH2O 11 μL。PCR反应条件为 ：95℃ 5 min；95℃ 50 s，56℃50 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 5 min。参照刘丽辉等［6］的方法。之后使用GIS与TREECONW软件对所得电泳图谱进行聚类［9］。

1.2.3 16S rRNA基因系统发育学分析 16S rRNA基因扩增使用通用引物27F 和1492R。PCR反应体系 为（25.0 μL）：ddH2O 10.5 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，27F 0.5 μL，1492R 0.5 μL，DNA 模板（40 ng/μL）1 μL，PCR 反应程序：95℃ 5 min；95℃ 50 s，56℃ 50 s，72℃ 50 s，32 个循环 ；72℃ 5 min。由广州天一辉远公司对扩增产物测序。在NCBI数据库中对所得序列进行16S rRNA BLASTN比对，将同源性最高的模式菌株与代表菌株用MEGA X软件进行多序列比对，用Neighbor Joining法构建系统发育树。

1.2.4 百香果内生菌生理生化鉴定 革兰氏染色、甲基红测定、产氨实验、乙酰甲基甲醇实验、脲酶测定、明胶液化测定、H2O2酶测定、NO3-还原实验等均参照《微生物学实验教程》［10］进行。

1.2.5 菌株固氮酶活测定及nifH基因扩增与分析 固氮能力的测定：将各类群代表菌株分别置于LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床中，120 r/min培养24 h，用无菌水稀释成OD600为1的菌液，取10 μL接种于有3 mL半固体DN培养基的10 mL试管中，用经H2O2灭菌的胶塞密封，并用封口膜封住胶塞与试管连接处，置于37℃恒温箱培养24 h，确定菌株定植于试管中后，用乙炔还原法（ARA）对其进行固氮酶活性测定，先抽取剩余空气1/100体积的试管内气体，之后向试管中注入等体积的100%乙炔气体以确保气压一致。在37℃恒温箱培养48 h后，用1 mL注射器从试管中抽取0.5 mL气体注入气相色谱，用气相色谱仪测定乙烯与乙炔峰面积，进行3次重复，取平均值。

nifH基因的扩增参照Zehr等［11］的方法，引物使 用 Zehr-F（5′-TGYGAYCCNAARGCNGA-3′） 和Zehr-R（5′-NDGCCATCATYTCNCC-3′）（D：A，G 或 T；N：A，C，G或 T；Y：C或 T；R：A或 G）。PCR反应程序 ：97℃ 3 min ；97℃ 60 s，55℃ 50 s，72℃35 s，32个循环；72℃ 5 min。扩增后的PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.6 菌株的促生特性 溶磷试验：将菌株活化后用过灭菌的牙签点种到PKO培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养2-5 d，通过观察菌落周围是否形成透明圈，判断菌株是否具有溶磷能力，有透明圈则说明菌株具有溶磷能力。采用钼锑抗比色法对各菌株溶磷能力大小进行测量［12］。

解钾试验：将菌株活化后用过灭菌的牙签点种到钾细菌固体培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养2-5 d，通过观察菌落周围是否有透明圈，判断菌株是否具有解钾能力，有透明圈则说明菌株具有解钾能力。采用四苯和硼酸钠法对各菌株溶磷能力大小进行测量［13］。

分泌生长素试验：定性分析：将菌株活化后接种至King液体培养试管中，每个菌株设3个重复，置于摇床中28℃、120 r/min培养2 d。吸取50 μL菌悬液于陶瓷比色板上，加入等量比色液，设阴性对照和阳性对照，阴性对照加入50 μL未接菌的King液体培养基，阳性对照中加入50 μL浓度为10 mg/L的植物生长激素（IAA），之后在黑暗条件下静置半个小时，观察颜色变化，能产生生长素的菌株其混合液在静置后会变为粉红或红色；定量分析：使用纯的3-吲哚乙酸（3-IAA）制作标准曲线，采用Salkowski比色法［6］，对代表菌株分泌生长素的能力进行测定。

产铁载体试验：将菌株接种于MSA-CAS液体培养基中，置于37℃恒温摇床，120 r/min培养3-5 d，观察培养基变色情况，未变色则菌株不具有产铁载体能力，如果培养基颜色变为粉红色则菌株具有分泌铁载体的能力。

产蛋白酶实验：用脱脂奶粉琼脂固体培养基对菌株进行产蛋白酶能力测定。A组分：Skimmed milk powder 35.0 g，500 mL H2O，B组分：Agar 20.0 g，500 mL H2O，A与B组分在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30 min，A与B组分分开灭菌以防止结块，灭菌完成后待其温度降至60℃左右时快速混匀后制备产蛋白酶检测平板。用灭过菌的牙签将菌株点种在培养基中央，置于37℃恒温培养箱中培养5 d后，观察菌落周围是否有透明圈形成，有透明圈出现则说明菌株具有产蛋白酶能力，通过计算透明圈直径与菌落直径的比值确定菌株产蛋白酶能力大小。

2 结果

2.1 百香果内生细菌的分离和纯化

经分离纯化后共得到51株百香果内生细菌。具体结果如表1所列。51株内生菌是从不同组织中分离得到的，其中根中分离到31株，茎中分离到13株，叶中分离到7株。

表1 百香果内生细菌菌株统计表Table 1 Strains isolated from P. edulia Sims

2.2 分离菌株IS-PCR指纹图谱聚类分析

根据IS-PCR指纹图谱的结果（图1），使用TREECONW软件将51株细菌聚为12类（图2）。不同类群菌株指纹图谱的条带位置及数量之间存在明显区别，显示出各类群之间分子水平上的差异。

图1 百香果51株内生菌IS-PCR指纹图谱电泳图Fig.1 IS-PCR fingerprinting patterns of 51 endophytes in P. edulia Sims

图2 百香果51株内生菌的IS-PCR指纹图谱聚类（UPGMA）Fig.2 Dendrogram of IS-PCR fingerprinting patterns（UPGMA method）of 51 endophytes in P. edulia Sims

2.3 菌株16S rRNA基因序列分析

对12个类群的代表菌株进行16S rRNA基因序列测定，测定结果在NCBI数据库中用BLASTN进行相似度比对，结果见表2，使用MEGA X将相似性最高的模式菌株与代表菌株的基因序列用邻接法进行聚类分析并构建系统发育树（图3）。

图3 各类群代表菌株16S rRNA基因序列系统发育树（邻接法）Fig.3 Phylogenetic dendrogram of 16S rRNA gene sequences for representative strains（Neighbor-joining method）

表2 百香果各类群代表菌株16S rRNA基因序列相似性比对结果Table 2 Comparison results of 16S rRNA gene sequence similarity of representative strains of various groups of P. edulia Sims

2.4 代表菌株生理生化鉴定

通过对各类群代表菌株所做的生理生化试验得到结果如下（表3）。具有固氮酶活性的代表菌株有 BXG81、BXG212、BXG201、BXJ71、BXG53，其中BXJ71具有最高的固氮酶活性，达到447.93 nmol C2H4/（mL·h）。固氮酶nifH基因电泳图见图4，可见菌株BXG81、BXG212、BXG201、BXJ71和BXG53在约360 bp处扩增出的nifH基因条带。

图4 代表菌株nifH基因PCR扩增产物电泳图Fig.4 PCR products of the nifH gene in representative strains

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2.5 代表菌株的促生长特性

对各类群代表菌株进行可溶性磷定量测定，可溶性钾定量测定，产蛋白酶定性试验，产铁载体能力试验，产生长素定量试验，结果见表4。菌株 BXG111、BXY92、BXG212、BXG101、BXJ71、BXG53具有溶磷能力，菌株BXG129、BXY92、BXJ201、BXG81、BXG212、BXJ71、BXG53 具有解钾能力，菌株 BXG95、BXG129、BXG92、BXY92、BXG81、BXG212、BXG101、BXG201、BXJ71、BXG53具有产生长素能力，菌株BXG81、BXJ71、BXG53具有产铁载体能力，菌株BXG95、BXG129、BXY92、BXG201、BXJ71具有产蛋白酶能力。其中BXJ71具有各试验测试的促生能力，BXG53、BXY92和BXG212也具有多种促生能力（图5）。

图5 部分代表菌株促生特性Fig.5 Growth-promoting characteristics of some representative strains

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3 讨论

本研究以百香果为材料从中分离纯化出了51株菌株。这51株内生菌系统发育分析聚类为12类，10个属12个种，分离部位是从百香果植株不同部位获得的，体现了百香果内生菌的遗传多样性，同时具有多种促生长特性，内生菌的固氮酶活性随分离部位及其种属不同而显示出一定的差异，分布在21.11-477.93 nmol C2H2/（mL·h）之间。Farhana等［14］对小麦内生菌进行分离纯化，得到了7个属15种不同的内生菌，对其进行了植物促生和促进植物抗逆性的试验，得出小麦内生菌可通过分泌大量有益的促生代谢物促进植物生长并帮助寄主植物在逆境下生存；Bram等［15］对杨树根际细菌和植株内生菌群落的结构变异及生态位分化的研究表明，杨树内生菌在属及以上的OUT水平显示，根中以Rhizobiales、Rhizobium属为主，茎中主要以Pseudomonas、Methylobacterium、Deinococcus属为主，叶中以Pseudomonas、Sphingomonas、Methylobacterium属为主，同时证明了田间生长的杨树内生微生物组的结构变异性远高于根际微生物组，这种更高的变异性可能与植物不同组织部位的生理环境差异和植物因外界环境变化而导致的体内营养物质、水分、激素等的变化有关。本研究的百香果属于藤本植物，我们从其中分离得到了10属12个种的内生菌，证明百香果内生菌具有丰富的遗传多样性，上述研究表明在草本和木本植物中也都有丰富的内生菌存在，这些不同种属的内生菌有着多样的生物学功能，可通过自身代谢和生长对植物产生促生及抗逆境胁迫等多种影响，对微生物多样性研究和具有特异性功能菌株的开发有着重要的意义，同时更高的变异性也意味着植物内生菌对拓展微生物种质资源和研究不同微生物群落间相互作用有着极高的价值。进一步可将百香果功能菌株回接作物进行盆栽实验和大田实验，研究功能菌株对作物促生、抗病等功能的效果，进而使其能服务于农业，为农业生产做出贡献。

本文分离纯化得到的Ⅰ类群Bacillus altitudinis细菌最早是从收集高海拔空气样品的低温管中分离得到的［16］，与类群Ⅱ的Bacillus circulans位于同一个属，其都有产生长素的能力且在12个类群中最强，说明它们在促进植物生长发育方面优势更加明显，且类群Ⅰ的代表菌株BXG95产蛋白酶能力在12个类群中最强，而类群Ⅱ的BXG129又具有解钾能力。Baliyan等［17］在对可促进鹰嘴豆生长的菌株研究中发现，从鹰嘴豆根际土壤分离出的MRN16同Bacillus altitudinis有99%的相似性，而此菌株在最优环境下的产生长素能力在2 d时约为30-40 mg/L，同本研究得出的24.32 mg/L较为接近，本试验结果偏低的原因可能为菌株生长环境并非为最优导致的，同时MRN16菌株对鹰嘴豆种子发芽的促进作用明显，我们推断类群Ⅰ的代表菌株BXG95也具有良好的促生作用。

类群Ⅴ的Paenibacillus illinoisensis细菌是由F. E.Clark［18］从土壤中发现的，Paenibacillus属和Bacillus属最早在分类学上同属于一个属，后来于1993年由Ash等［19］提议将部分菌划分为Paenibacillus属。本试验类群Ⅴ代表菌株BXY92具有溶磷、解钾、产生长素和产蛋白酶多种能力，且解钾和产蛋白酶能力较强。Liu等［20］对Paenibacillus illinoisensis细菌促进花生生长的能力进行了田间试验，结果表明接种Paenibacillus illinoisensis细菌的植株荚果产量比对照提高了37.05%，对植株全氮、磷、钾的积累具有促进作用，这同本研究对类群Ⅴ代表菌株BXY92进行的促生特性试验结果相符合。

类群Ⅶ的Rhizobium pusense细菌是由Digvijay等［21］于2011年从鹰嘴豆的根际分离并命名的，其属于根瘤菌属，虽然大众会有根瘤菌是同豆科植物根茎共生的印象，但是其共生特性在遗传上是不稳定的，这增加了非共生根瘤菌在其他植物根茎、土壤中发现的可能性，因此一些从其他植物根茎、土壤中发现根瘤菌的现象有被报道，Soberon-Chavez，Quigley等［22-23］在土壤中发现过根瘤菌，Segovia，Yanni和Mónica等［24-26］在根际土壤和其他植物根茎中发现过根瘤菌。本试验类群Ⅶ的代表菌株BXG81分离部位是百香果植株的根系，这也验证了根瘤菌可在豆科植物根瘤以外的植物组织存在，其具有生物固氮、解钾、产生长素和分泌铁载体能力，微生物通过合成分泌自身生存需要的铁载体使其能在低铁环境中螯合环境或宿主细胞中的铁，为其生长提供了铁元素，有研究表明具有产铁载体能力的细菌可以降低土壤重金属含量［27］，还对植物具有促生能力［28］，并能增强植物抵抗病原菌的能力［29］。

类群Ⅷ的Beijerinckia fluminensis细菌最早是从巴西不同地区收集的土壤样品中分离得到的［30］。本试验类群Ⅷ的代表菌株BXG212具有生物固氮、溶磷、解钾和产生长素的能力。Krupali等［31］对多种药用植物进行内生菌分离和纯化后得到了5株具有促生作用的菌株，其中从姜黄根茎中分离出的C-1菌株经鉴定为Beijerinckia fluminensis细菌，促生功能试验结果同本研究结果一致，同时其对C-1菌株也扩增出了nifH基因，再次从基因层面证明了其具有生物固氮的功能。

类群Ⅺ的Klebsiella michiganensis细菌最初报道是从美国密歇根州一个家庭的牙刷架上分离得到的，后来也有从植物组织中分离出来的报道［32］，与类群Ⅻ的Klebsiella pneumoniae细菌同属Klebsiella属，K.pneumoniae有从多种植物中分离出的报道［33-35］。付思远等［36］对泓森槐内生固氮菌的分离中得到了和K. michiganensis细菌相似度为100%的菌株，其分离部位是植株的茎秆部分，具有固氮酶活性和多种促生作用，本实验类群Ⅺ也主要由茎中分离同样具有固氮酶活性且所具有的促生作用相似，而本试验类群Ⅺ中有一株菌为根系中分离，可能表明K.michiganensis细菌主要分布于植物茎中但也有少数情况可在植物根系中定植。龚凤娟等［37］对杜仲内生细菌进行分离得到了5株内生细菌，其中分离出了和K. pneumoniae细菌相似度为99%的菌株，其具有ACC脱氨酶活性和抑菌作用，具有ACC脱氨酶活性的植物根际和内生细菌对提高植物抗逆境胁迫中有重要作用，而其抑菌作用可能与其具有分泌铁载体能力有关。本试验这两个类群的代表菌株BXJ71和BXG53都具有生物固氮、溶磷、解钾、产生长素和分泌铁载体的能力，BXJ71又具有产蛋白酶能力且生物固氮能力在12个类群中最强，说明其对植物氮素的提供上有较强的促进作用，而BXG53的溶磷和解钾能力在12个类群中最强，说明其对植物磷、钾元素的提供上有较强的促进作用。

4 结论

本研究分离得到百香果内生菌51株分属于12个类群，为10个属的12个种，其中从根中分离得到31株，茎中分离得到13株，叶中分离得到7株，通过各促生特性试验结果表明从百香果中分离得到的内生菌不但具有种群多样性，而且具有功能多样性，百香果内生菌除了具有溶磷、解钾、分泌生长素功能，还有具有生物固氮和产铁载体等促生功能于一体的菌株，其中菌株K. michiganensis BXJ71有最高的固氮酶活性，与K. pneumonia BXG53、Beijerinckia fluminensis BXG212在各方面的促生能力都很强，是集多种功能于一体的微生物种质资源，在农业生产方面具有广阔的应用前景。