桄榔抗性淀粉调控保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌的增殖及耐受性

李梦赟，任民红，刘远森，张露，梅江洋，符珍

（广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004）

抗性淀粉（resistant starch，RS）作为一种新型的膳食纤维且属于淀粉的一部分，它有着多种类型且以“不被健康个体小肠所吸收的淀粉及其降解物”为定义，它因对胃肠中消化酶等的抗性，从而对胃肠道微生物群落的组成和活性有一定的影响，进而影响人体健康[1]。RS具有改善胰岛素敏感性，调节糖脂代谢、调节肠道菌群、促进矿物质的吸收和利用等多种潜在的生理功能[2-5]。RS目前可分为五大类，比如存在于在谷物或种子的蛋白质基质和细胞壁中的物理性包埋淀粉（physically trapped starch，RS1）、像土豆中含有的不被消化酶消化的天然抗性淀粉颗粒（resistant starch granules，RS2）、因糊化老化而产生的回生淀粉（retrograded starch，RS3）、以及化学改性淀粉（chemically modified starch，RS4）和直链淀粉-脂肪复合淀粉（amylose-lipid complexed starch，RS5）5类[6]。根据来源、处理方式和制备方法的不同，抗性淀粉呈现不同的颗粒形状、不同的晶体结构和不同的分子结构[6，7]。

RS的功能和营养价值，特别是其生理意义，取决于其结构。抗性淀粉作为新型益生菌制剂，制备工艺简单、口感好、来源也广，开发和充分利用抗性淀粉作为益生元来源成为当前研究热点。林珊[8]以压热法制备的莲子淀粉饲喂小鼠发现莲子抗性淀粉能够促进肠道益生菌的增殖及产酸能力；包辰等[9，10]则通过不同的加工工艺制备出多种抗性淀粉，他们的结晶区和螺旋结构等存在差异，且有着不同的益生菌增殖效果和产酸能力，不仅印证了薏苡仁抗性淀粉对两歧双歧杆菌耐受性的增强作用，且展现出不同加工处理方法获得的抗性淀粉之间益生元性质的差异；崔琳琳等[11]通过苦荞抗性淀粉的体外发酵实验确定了它的益生元作用，且发现不同剂量的苦荞抗性淀粉对有害菌的抑制程度不同。杨玥熹等[12]研究了以玉米、绿豆和葛根等植物来源制备的B型抗性淀粉（RS），并将这几种抗性淀粉作为碳源进行厌氧培养，发现大肠埃希氏菌、干酪乳杆菌、长双歧杆菌在不同的抗性淀粉为碳源的培养中出现了不同的增殖过程和pH变化。近年来的研究证明，以莲子、薏苡仁、苦荞等原料制备的抗性淀粉可以被大肠杆菌发酵，并产生多种短链脂肪酸如甲酸、乙酸和丁酸等和二氧化碳、氢气等气体，有利于降低肠道pH值，对致病菌的生长和繁殖有抑制作用，且促进益生菌的增殖[2，3，5，13]；并且众多实验研究发现植物来源、加工方式以及添加剂量的不同会对抗性淀粉的益生元潜力产生不同趋势的影响。因此对不同植物来源的原材料进行研究不仅对资源开发有一定的意义，且一定程度上促进了对抗性淀粉的益生元功用和机理更加全面地了解。在众多原材料的研究中，很少有人对桄榔这一棕榈科的材料进行益生元潜力的探究，所以本实验主要讨论该材料的益生元作用。

桄榔粉是广西传统特产，作为广西四大名粉之一。它不仅富含多种微量元素，还有丰富的碳水化合物和膳食纤维。桄榔淀粉（Arenga pinnatastarch，APS）是桄榔粉的主要成分并且直链淀粉含量较高[14]，是制备RS优质原料。前期研究表明桄榔抗性淀粉（APRS）具有很好的抗酶解性和高热稳定性[15]。因此，本论文进一步采用体外发酵研究考察不同浓度（0.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%）APRS对保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus，LB）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，LP）增殖作用及在模拟人体胃肠道逆环境中的耐受能力影响，以观测APRS是否有益生元潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桄榔粉，广西龙州农业推广中心；酪蛋白胨，上海源叶生物科技有限公司；琼脂粉，上海源叶生物科技有限公司；牛肉粉、酵母粉、牛胆酸钠、胃蛋白酶、胰蛋白酶，索莱宝科技有限公司；柠檬酸氢二铵、吐温-80、磷酸氢二钾、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、碳酸钙，广西南宁楚杰生物科技有限公司；乙酸钠、葡萄糖，广西南宁沁田生物科技有限公司。普鲁兰酶（2000 u/mL），美国Sigma公司；α-淀粉酶（10 u/mg），Solarbio Bio-Technology Co.Ltd.；葡糖淀粉酶（100 u/mg），Doulai Bio Technology Co.Ltd.。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2F洁净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；G180TW高压灭菌锅，宁波甬安医疗器械制造有限公司；LRH-250-Z振荡培养箱，广东省医疗器械厂；CR21N超速离心机，天美（中国）科学仪器有限公司；JJ300Y电子天平，上海仁沃实业发展有限公司；722可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；TL-18M 台式高速冷冻离心机，上海市离心机械研究所有限公司。

1.3 供试菌种

保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus，LB），北京川秀科技有限公司；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，LP），中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC，1.2469）。

1.4 试验方法

1.4.1 桄榔抗性淀粉的制备

根据实验室前期报道的方法[15]制备APRS：

淀粉乳→水浴糊化→普鲁兰酶酶解→灭酶→超声波处理→冷藏→洗涤，离心→干燥→粉碎，过筛→抗性淀粉

对桄榔淀粉进行称重，并与醋酸钠缓冲液（pH 4.5）混合，配制8%的淀粉乳液。沸水浴中糊化并持续搅拌30 min，然后冷却至适宜温度；加入普鲁兰酶（普鲁兰酶添加量3.74×103U/g）酶解14.3 h，沸水浴10 min灭酶，灭酶后40 ℃水浴超声处理36 h（功率定为120 W），加入乙醇（醇:水=9:1V/V）于4 ℃回生24 h，取出后离心，于70 ℃干燥24 h，用粉碎机粉碎后过筛，制得最高含量的抗性淀粉，置于干燥器中保藏。

1.4.2 培养基配置

MRS基础培养基配方：蛋白胨，10 g；牛肉粉，10 g；酵母粉，5.0 g；葡萄糖，5.0 g；乙酸钠，5.0 g；柠檬酸氢二铵，2.0 g；吐温-80 1.0 mL；磷酸氢二钾，2.0 g；MgSO4·7H2O，0.2 g；MnSO4·H2O，0.05 g；碳酸钙，0.5 g；琼脂，13 g；蒸馏水，1000 mL；pH 6.8。PBS缓冲液（1 L）：氯化钠，8 g；氯化钾，0.2 g；磷酸氢二钠，1.44 g；磷酸二氢钾，0.24 g；pH 7.4，定容至1 L。试验培养基及配方：以不同浓度（0.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%）的 APRS粉替代葡萄糖作为碳源配制而成，其他成分与基础培养基相同。

1.4.3 菌种活化

在无菌室内，将接种环灭菌后，在 MRS固体培养基上蘸取冻存管中的菌液进行划线，37 ℃厌氧培养48 h，挑取菌落在10 mL MRS液体培养基中37 ℃厌氧培养24 h，菌液1 mL接种到25 mL已灭菌的MRS培养基中，37 ℃厌氧培养48 h，活化2次后得到第3代菌种，用30%甘油以1:1比例放在冻存管中，之后将冻存管放入-80 ℃冰箱冻存菌种备用。保加利亚乳杆菌的活化方法同植物乳杆菌。保加利亚乳杆菌的活化方法与植物乳杆菌相同。

1.4.4 菌悬液制备方法

吸取等体积培养后的液体培养基以3000 r/min离心15 min，去除上清液。用去离子水洗涤沉淀菌体2次后移至无菌试管，去离子水定容至15 mL，螺旋振荡器充分振荡试管20 s，制成菌体悬液。

1.4.5 不同浓度的APRS对LP和LB增殖作用的影响

取60个25 mL的厌氧管，分别配制25 mL葡萄糖基础培养基和APRS的试验培养基，碳源浓度分别为：0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、1.5%，121 ℃灭菌20 min，冷却至室温，用移液枪给每根厌氧管移入1 mL经 3次活化后的植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌菌悬液，37 ℃厌氧培养48 h后，在600 nm处测定各培养基的吸光值，每组3个重复。

1.4.6 APRS对LP和LB生长过程的影响

根据不同浓度的APRS对乳酸菌增殖结果，选择基础培养基和试验培养基中增殖效果最明显的碳源浓度，分别配制最适浓度的基础培养基和试验培养基，121 ℃灭菌20 min。取活化后的植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌菌悬液1 mL分别接种到25 mL基础培养基和试验培养基中，37 ℃厌氧培养48 h。分别以不添加菌液的基础培养基和试验培养基为空白，于0、2、4、6、8、10、12、14、16、20、24、28、32 h 取少量菌液测定600 nm处的吸光度值，每组设3次重复。以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，分别绘制LP和LB的生长曲线。

1.4.7 APRS对乳酸菌在模拟胃肠道逆环境中耐受性的影响

1.4.7.1 耐胆汁酸盐试验

配制基础培养基活化冻存的菌种，48 h后取出分装在无菌的离心管中，8000 r/min离心10 min去除上清液待用。用磷酸盐缓冲溶液调试验培养基pH至7.0，分别加入0.3%、1%、2%的牛胆酸钠，121 ℃灭菌20 min，分别添加到待用的菌体离心管中。37 ℃厌氧培养，分别培养0、12 h后取样稀释涂布在无菌平皿中，测定活菌数。

1.4.7.2 耐酸性试验

配制基础培养基活化冻存的菌种，48 h后取出分装在无菌的离心管中，8000 r/min离心10 min去除上清液待用。分别用37%盐酸溶液调试验培养基pH至1.5、2.5、3.0，121 ℃灭菌20 min，分别添加到待用的菌体离心管中。37 ℃厌氧培养，分别培养 0、3 h后取样稀释涂布在无菌平皿中，测定活菌数。

1.4.7.3 模拟胃肠道试验

配制基础培养基活化冻存的菌种，48 h后取出分装在无菌的离心管中，8000 r/min离心10 min去除上清液待用。用37%盐酸溶液调试验培养基pH至3.0，121 ℃灭菌20 min后加入0.5%经紫外线灭菌处理60 min的胃蛋白酶作为模拟胃液，充分混匀后分别添加到待用的菌体离心管中。37 ℃厌氧培养，分别培养0、3 h后取样稀释涂布在无菌平皿中，测定活菌数。

配制基础培养基活化冻存的菌种，48 h后取出分装在无菌的离心管中，8000 r/min离心10 min去除上清液待用。用磷酸盐缓冲液调试验培养基pH至7.0，121 ℃灭菌20 min后加入1.0%经紫外线灭菌处理60 min的胰蛋白酶作为模拟肠液，充分混匀后分别添加到待用的菌体离心管中。37 ℃厌氧培养，分别培养0、3 h后取样稀释涂布在无菌平皿中，测定活菌数。

1.4.7.4 LP和LB存活率

梯度稀释后，用移液枪取100 μL菌液涂布在培养皿中，37 ℃条件下厌氧培养 48 h，选择菌落数在30～300的平板进行计数。菌落总数的计算方法是：计算两个平板上菌落总数的平均值，再乘以相应的稀释倍数，即每g（mL）样品中菌落总数。菌种存活率计算公式：

式中：

N1——处理后的活菌数，cfu/mL；

N0——初始活菌数，cfu/mL。

1.5 统计方法

试验数据采用SPSS进行显著性分析，采用Origin pro 9.1对数据作图。

2 结果与讨论

2.1 APRS对LP和LB增殖作用的影响

碳源浓度对菌体生长状况起着决定性的作用，菌液的吸光度值可作为检测细菌增殖的指标[16]。从图1a可以看出，APRS浓度为0.5%时，LP的OD达到最大值为0.94；葡萄糖（Glucose，GLU）浓度为1%时，OD最大值为1.29。从图1b可以看出，APRS浓度为0.2%时，LB的OD达到最大值为0.91；葡萄糖浓度为1%时，OD最大值为1.39。

在碳源浓度为0.5%时，与GLU相比，APRS为碳源的培养基中的LP的OD值达到了该培养基下的最高值在0.2%时，APRS为碳源的培养基中的LB的OD值最高，且均大于同等浓度GLU碳源下的LP和LB的OD值。表明APRS对LP和LB生长的影响在低浓度下的增殖效果更佳。当各碳源浓度大于5%时，GLU碳源的OD值大于APRS的OD值，且随着APRS浓度的增加，目标菌液的OD值逐渐下降。表明高浓度的APRS对LP和LB的生长有抑制作用。刘树兴等[17]发现当回生型抗性淀粉（RS3）的浓度达到1%时，以RS3为碳源的培养基中LB的OD值最大为1.77，RS3浓度为2%时，嗜酸乳杆菌OD达到最大值1.99，与GLU为碳源的培养基对比可知，RS3的增殖作用最为突出，但随着RS3浓度的增大，菌体数量呈先增大后减小的趋势。与本实验的对比结果及趋势相一致，不同点在于两个实验的碳源浓度即抗性淀粉的浓度不同。推测原因可能是LB和LP利用APRS产生了乙酸等短链脂肪酸，对菌体的生长产生了一定程度的抑制作用；而不同的抗性淀粉制备方式使两个实验的原料必然存在一定的结构等差异，有可能是造成二者在不同的抗性淀粉浓度下出现相似趋势的原因。

2.2 APRS对LP和LB生长过程的影响

从图2可看出，LP和LB在两种碳源的培养基中有4 h的生长迟滞期，这段时间内菌体数量没有发生显著变化。4 h后乳杆菌进入对数生长期，12 h后进入稳定生长期，菌体数量不再发生明显变化，该实验结果与邢海楠[18]报道的结论相似。LP和LB在APRS的培养基中的OD值整体高于GLU培养基，LP和LB在APRS培养基中的生长速率较快，菌体数量比较高，即APRS促LP和LB能力强于葡萄糖培养基，且对乳酸菌的生长具有显著的促进作用。其他研究表明莲子、绿豆、马铃薯、锥栗和板栗抗性淀粉对乳酸杆菌也具有促进作用[8，17，19]。LP和LB都属于乳酸杆菌，在APRS培养基发酵12 h左右后乳酸杆菌数量已经趋于稳定，而在谢涛等[19]研究发现乳酸杆菌的最大增值在 20 h左右出现。稳定生长期的不同可能与菌种的不同而产生差异，而最大增值的差异可能与不同原料来源的抗性淀粉的表面沟壑结构有关。

2.3 APRS对LP和LB在模拟胃肠道环境中耐受性的影响

LP和LB生长曲线结果表明APRS在非逆环境培养基中对乳酸菌的增殖具有显著影响，但益生菌在肠道内的生长状况还受胃肠道环境各因素的影响，故通过体外模拟胃肠道逆环境，以葡萄糖为对照，分别研究APRS对乳酸菌抗胆汁酸盐以及模拟胃肠液中耐受性的影响。

2.3.1 APRS对LP和LB抗胆汁酸盐耐受性的影响

益生菌在小肠中需要耐受住高渗透环境而存活，人体的小肠高渗透环境主要是由胆汁酸盐造成的，成人正常小肠的胆汁浓度为0.03%～0.30%[20]。由表1可得，对比两种不同碳源的培养基中两种乳酸菌的存活率，碳源为APRS的培养基显著高于以葡萄糖为碳源的培养基。当胆汁酸盐浓度为0.3%时，菌体存活率保持在80%以上，且乳酸菌在APRS的培养基中存活率高于葡萄糖且差异显著（p＜0.05）。随着胆汁酸盐浓度增加，LP和LB在1%胆汁酸盐环境中菌落总数有所减少，但仍然能维持在50%以上，LB的存活率略高，抗逆性较强[21]。可以看出APRS对LB和LP的耐胆酸盐、低pH的耐受性效果良好。当胆汁酸盐浓度为2%时，菌体存活率急剧下降，LB在葡萄糖培养基中已经无法检出。刘树兴等[8，17]发现嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌在 0.5%胆汁酸盐环境下生长茂盛；2%胆汁酸盐环境条件下无LB检出也与林珊的结果相符。这可能是因为极端的酸环境并且作用时间较长，导致乳酸菌的黏附作用被破坏，使得乳酸菌无法受到APRS的保护，改变了菌体外膜的通透性，对菌体生长存活产生一系列的抑制作用，导致乳酸菌存活率下降[22，23]。

表1 LP和LB在含胆汁酸盐的不同碳源培养基中的存活率/%Table 1 Survival rate of LP and LB in different carbon source mediums containing bile salts

2.3.2 APRS对LP和LB耐酸性的影响

胃酸的 pH会根据人进食时间和所食食物的种类等因素变化，一般波动幅度在1.5～4.5之间。由表2可知，当培养基pH为3.0时，两种菌生长良好，在APRS培养基中的活菌数均高于葡萄糖培养基且差异性均显著（p＜0.05），并且保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌在各组培养基中存活率均在70%以上，表明APRS可增强两种益生菌在低pH环境中的耐受性。当培养基pH为2.5和1.5时，培养3 h后在APRS和葡萄糖为碳源的培养基中无法检验出存活的乳酸菌，且差异性均显著（p＜0.05），说明过低的pH对于LP和LB的生长有严重的抑制作用。这与仝千秋[24]的在pH为2.0条件下无LB存活的实验结果相符。对比玉米抗性淀粉的体外发酵结果可知，在同等pH值下，抗性淀粉培养基中的菌种数目和生长速率均高于GLU培养基，pH 3.0时的生长速度高于pH 2.0时的生长速度，且嗜酸乳杆菌的生长优势最为突出[17]。综上所述，APRS对LP和LB低pH耐受性较葡萄糖好，原因可能与APRS表面沟壑状结构为乳酸菌提供保护有关[8，17]。

表2 LP和LB在低pH值不同碳源培养基中的存活率/%Table 2 Survival rate of LP and LB in different carbon source medium at low pH

2.3.3 APRS对LP和LB抗模拟胃肠液耐受性的影响

APRS对LP和LB模拟胃肠液耐受性的影响结果见表3所示。由表3可知，在胃蛋白酶环境下，以APRS为碳源的培养基中培养3 h后，LP和LB的存活率与葡萄糖相比差异显著且具有统计学意义（p＜0.05），表明桄榔 APRS可以增强乳酸菌模拟胃液耐受性的能力。而经研究发现，莲子抗性淀粉对嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌胃肠液耐受性无显著影响，这可能与菌种的不同有关[8]。在模拟胰液环境下培养，以APRS为碳源的培养基中培养3 h后LP和LB的存活率与葡萄糖相比无明显差异（p＞0.05），这与刘树兴等人[17]的实验结果相一致，可能是因为胰蛋白酶降低了LP和LB对桄榔APRS的黏附作用，使益生菌暴露在肠液环境中，无法受到 APRS 特殊结构的保护[16，25，26]。

表3 LP和LB在含模拟胃肠液的不同碳源培养基中的存活率/%Table 3 Survival rate of LP and LB in different carbon source mediums containing simulated gastrointestinal fluid

3 结论

随着APRS浓度增加，LP和LB液浓度先稍微增大然后显著降低；低浓度下APRS可促进LB和LP的生长且增殖效果优于葡萄糖，但高浓度（1%～1.5%）不利于LB和LP的生长；APRS可显著增强LB和LP耐酸性环境、高浓度胆汁酸盐以及胃液逆环境（p＜0.05）。APRS提高乳酸菌模拟肠液耐受性的能力与葡萄糖对比无差异，表明桄榔APRS可能具有较好的耐消化特性。因此，APRS具有潜在的益生元作用可为其进一步开发提供理论参考。