青海省猪粪和油菜秸秆发酵菌种的筛选

孙 健，张鑫鹏，李松龄，王亚艺

(1.青海大学，青海 西宁 810016； 2.青海大学农林科学院，青海 西宁 810016)

近年来，青海省大中型生猪养殖场迅速兴起，2019年青海省生猪出栏量达98.77万头，产生猪粪19.75万吨。油菜种植业也进入积极发展阶段，油菜产量达到28.66万吨，产生油菜秸秆42.99万吨[1]。如此大量的猪粪和油菜秸秆若不能被合理利用，不仅造成资源的浪费，而且危害人类健康、污染环境。好氧堆肥是有机废弃物资源化和无害化的重要手段，将猪粪和油菜秸秆进行好氧堆肥，可以让油菜秸秆作为高碳源物质调节猪粪堆肥的碳氮比、孔隙度和含水率[2]。好氧堆肥时接种微生物菌种，不仅可以促进堆肥温度，还能提高堆肥效率。李昌宁等[3]研究发现，在猪粪和玉米秸秆的堆肥中接种微生物菌种可以促进堆体升温并延长高温时期，缩短堆肥腐熟周期，加快总有机质的分解，最终提高堆肥产品中的养分含量。青海省位于中国西北内陆，全省平均海拔3 000 m以上，气候冷凉，由于特殊的气候环境，传统堆肥很难达到杀死病原菌的温度，因此向堆肥接种微生物菌种十分重要。本研究在猪粪和油菜秸秆好氧堆肥的基础上分别添加7株发酵微生物菌种，通过对接种微生物菌种堆体的理化性质和氮磷钾养分的测定，筛选出适合青海省猪粪和油菜秸秆的发酵菌种。

1 材料与方法

1.1 试验材料

堆肥原料猪粪来自于青海省泰和苑生物有限公司，油菜秸秆由青海省互助县昱青投资开发有限公司提供，原料基本理化性质见表1。7株发酵微生物菌种均购自北京市北纳创联生物技术研究院，分别为米根霉(Rhizopusoryzae)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、绿色木霉(Trichodermaviride)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和解脂耶氏酵(Yarrowialipolytica)。

表1 堆肥原料基本理化性质

1.2 培养基配方

综合PDA培养基[4]：马铃薯煮汁1 000 mL(200 g马铃薯去皮切块，放入蒸馏水中煮沸30 min，取滤液定容至1 000 mL)，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，葡萄糖20 g，维生素B110 mg，琼脂20 g，pH自然；121 ℃灭菌30 min。

MRS培养基[5]：酪蛋白胨10 g，牛肉提取物10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖5 g，乙酸钠5 g，柠檬酸二氨2 g，吐温80 1 mL，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.02 g，硫酸锰0.05 g，碳酸钙20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.8；121 ℃灭菌30 min。

YM培养基[6]：酵母提取物3 g，麦芽提取物3 g，葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2±0.2；121 ℃灭菌15 min。

1.3 微生物菌剂的制备

各菌种对应的培养基见表2。将试验所需菌种在固体平板培养基上活化，于30 ℃培育48 h后，分别接种于50 mL对应的液体培养基中，30 ℃ 180 r/min震荡培养48 h获得种子液，再以1%(v/v)的接种量将种子液转接至300 mL三角瓶中，每瓶装培养基150 mL。30 ℃ 180 r/min震荡培养72 h后得到液态接种体。

表2 各菌种对应培养基

1.4 试验设计

堆肥试验于2020年8月7日—9月31日在青海大学农林科学院发酵场进行。本试验共设8个处理，以添加自来水的处理为对照，其他每种处理仅添加1种菌液，每个处理3次重复，堆体共24个。将猪粪和油菜秸秆按照3∶1(m/m)混合[7]，每堆猪粪150 kg、油菜秸秆50 kg。将猪粪和油菜秸秆混合均匀后用自来水调节含水率至65%[8]。每堆按照接种剂质量和堆体质量比接种相应的菌液1%[9]，即每堆接种菌液2 000 mL，对照中添加2 000 mL自来水，物料配比如表3所示。为了使物料混合均匀，并确保有充足的O2以供微生物活动，本文采用人工翻堆方式进行翻堆[10]，在堆肥开始后每4 d翻堆一次，直至9月10日(共计34 d)，后熟阶段不翻堆，整个堆肥周期为55 d。

表3 堆肥试验设计

1.5 测定指标与方法

(1)取样方法。在堆体表面以下30 cm处采用五点采样法取样，取样后混合均匀分为两份：一份用于pH和电导率的测定，另一份用于全氮、全磷、全钾的测定。

(2)堆肥温度的测定。每天上午9：30和下午15：30，用4支不锈钢金属探杆温度计测定堆体表面以下30 cm处的温度。每个堆体取早上和下午温度的平均值为该堆体当天的堆肥温度，同时测量当天当时的环境温度。

(3)pH、电导率的测定。取10 g样品放于300 mL三角瓶中，加入100 mL蒸馏水，使得固液比为1∶10，180 r/min震荡30 min，取上清液测定pH、电导率，测定方法参照参考文献[11]。

(4)全氮、全磷、全钾、有机质的测定。全氮、全磷、全钾、有机质含量测定方法参照《土壤农化分析》[12]。

2 结果与分析

2.1 不同发酵菌对堆肥温度的影响

不同发酵菌对堆肥温度的影响见图1。

图1 各处理堆肥温度的变化Fig.1 Variations of temperature in each composting treatment

如图1所示，T1在堆肥第2天温度达到57.9 ℃，其他处理堆肥第5天温度才达到55 ℃以上，堆肥第9天所有处理温度达到60 ℃以上。整个堆肥过程中T1、T2 55 ℃以上的天数较多，分别为14 d和13 d；CK为10 d；T7天数最短，只有5 d；T3、T4、T5、T6 55 ℃以上的天数分别为12、8、10、8 d。T1、T6、T7堆肥第27天进入降温阶段，T5在第25天进入降温阶段，其余处理均在第29天进入降温阶段。由此说明，添加菌液的堆肥处理，进入高温期的用时短，持续时间长。

2.2 不同发酵菌对堆肥pH和电导率的影响

图2为堆肥过程中各处理pH的变化趋势图。由图可知，CK和各处理的pH均呈先升高后降低的趋势。堆肥进行到第15天时pH达到最大值，之后开始下降。其中，T2的pH在第16天达到最高，为9.74，堆肥结束时pH达到最低，为6.62；除T6、CK以外，其他处理pH最高值均达到9以上，且在堆肥结束时所有pH都下降到6.5左右。堆肥后期，由于有机酸的连续产生，pH逐渐稳定。由此说明，所有处理中T2的微生物活性最高。

图2 各处理pH的变化Fig.2 Variations of pH in each treatment

图3 各处理电导率的变化Fig.3 Variations of conductivity in each treatment

2.3 不同发酵菌对堆肥养分变化的影响

随着堆肥的进行，各处理全氮含量呈上升趋势(图4)。堆肥结束时所有处理的全氮含量比堆肥初始均有所增加。T1和T2的增幅最大，为14.13%和15.08%;T4增幅最小，为5.56%;T3、T5、T6、T7和CK分别增加6.28%、9.69%、6.45%、6.45%和7.73%。

图4 各处理全氮含量的变化Fig.4 Variations of total nitrogen content in each treatment

由图5可知，各处理堆肥前期全磷含量迅速增加，与全氮含量相比趋势相对稳定。堆肥结束后，T1和T2全磷含量增加最多，较堆肥前分别增加59.78%和62.46%；T6、T7分别增加45.3%和44.77%，T3、T4、T5和CK均增加30%左右。

图5 各处理全磷含量的变化Fig.5 Variations of total phosphorus content in each treatment

全钾含量的变化与全磷含量相似，呈逐渐上升趋势(图6)。整个堆肥过程中，CK的全钾含量一直处于较低水平；T1和T2全钾含量较堆肥前分别增加53.26%和53.56%。CK的全钾含量增加最少，为19.61%;其次为T7、T4、T6、T3、T5，分别增加33.31%、38.46%、42.00%、42.71%、46.5%。

图6 各处理全钾含量的变化Fig.6 Variations of total potassium content in each treatment

2.4 不同发酵菌对堆肥碳氮比的影响

本研究起始碳氮比为24.7∶1，随着堆肥的进行，碳氮比逐渐下降，试验结束时，除了T7和CK，其余处理的碳氮比最终都稳定在16∶1。碳氮比下降幅度最大的是接种了米根霉和米曲霉的T1和T2，与初始值相比分别下降了36.84%和39.68%;其次为T5和T6，分别下降了31.98%和30.36%;CK下降幅度最少，为19.84%(表4)。

表4 各处理碳氮比的变化

3 讨论与结论

本试验中所有处理的堆肥温度均能达到55 ℃以上，且维持天数至少超过5 d。其中T1和T2堆肥温度高于55 ℃的天数分别达到了14 d和13 d，堆体在堆肥初期温度上升更快，可以更早进入高温期，延长高温期天数，并能够杀灭90%以上的有害生物[14]，加快堆肥的腐化进程。

Tan等[15]研究表明，最适宜微生物发挥有效作用、保留堆肥养分的pH为5.5～8.0，本试验中所有处理的pH均在该范围之内。整个堆肥过程中各处理堆肥结束的电导率均小于堆肥初期,这可能是因为微生物在分解有机质合成腐殖质的过程中利用了无机盐离子。

徐谞等[16]研究发现，在堆肥发酵过程中，相关的好氧微生物加速了有机物质的分解，从而释放了更多的养分，增加了堆体的养分含量。本研究中，堆肥结束时所有处理的全氮、全磷、全钾含量均有不同程度的升高，其中T1和T2的全氮、全磷、全钾含量增加幅度优于其他处理。适宜的碳氮比是堆肥成熟的重要指标之一[17],本研究中所有处理的碳氮比均呈现降低趋势，这可能是因为随着堆肥发酵的进行，堆体中有机质的氧化分解速率远远大于蛋白质和多肽的降解速率导致的。堆肥结束时，所有处理的碳氮比均降到16左右，T1和T2下降幅度最大。

综上，接种米根霉和米曲霉的T1和T2显著提高了堆肥温度，且维持了较长的高温期，提高了堆体的养分含量，优于其他处理和CK。因此，无论是从无害化、腐殖化还是堆肥的质量来看，米根霉和米曲霉是适合青海省猪粪和油菜秸秆发酵的菌种。