良恶性胸腔积液中mRNA表达谱分析

彭丹 侯子亮 王爱丽 王金祥

胸腔积液是临床常见疾病，研究发现[1]42%～77%的胸腔积液是恶性胸腔积液，其中1/3以上的是肺癌胸膜转移。超过半数的恶性胸腔积液患者在诊断后6个月内死亡[2]，恶性胸腔积液的早期诊断和治有助于疗改善预后。但是，现有的诊断技术如胸水细胞学检查，难以鉴别恶性细胞和反应性间皮细胞，细胞学检查仅能鉴别40%的恶性胸腔积液[3]。研究提示[4-5]癌胚抗原(carcinoembryonic antigen ，CEA)和 细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)诊断恶性胸腔积液的敏感性较高，但其假阳性率又会削弱它的诊断效能。目前尚无有效的生物标记物鉴别良性及恶性胸腔积液，并且对于恶性胸腔积液的形成机制尚不明确。mRNA是由DNA的一条链作为模板转录而来，携带遗传信息，并能指导蛋白质合成，mRNA参与多种生物学过程，并且参与肿瘤的发生发展。我们在前期研究中[6]发现良恶性胸腔积液中有大量差异表达的mRNA，恶性胸腔积液沉淀物中相关的mRNA可能参与恶性胸腔积液的发生机制。本研究分析良恶性胸腔积液中差异mRNA，筛选出关键mRNA，并通过分析探索可能参与的调节机制。

资料与方法

一、一般资料

本研究符合《赫尔辛基宣言》的原则，我们收集首都医科大学附属北京潞河医院2018年1月至2018年12月收治的胸腔积液患者6例，均签署知情同意书，其中3例经胸膜活检或胸腔积液病理证实为肺腺癌患者，另3例胸水涂片镜检或PCR检测确诊为结核性胸膜炎，在样本采集时所有患者未接受任何抗肿瘤、抗结核治疗。

二、研究方法

标本处理：患者入院24小时内采用标准胸腔穿刺术抽取胸腔积液，10mL胸腔积液置于经肝素抗凝的离心管中，1200rpm离心5分钟，弃上清，留取沉淀物，使用TRIzol (Invitrogen, NY, USA)重悬沉淀物，按照厂家说明书提取总RNA，-80°冰箱保存。

mRNA芯片检测：首先对样品中总mRNA进行质控，采用Qubit 3.0 Fluorometer对微量RNA浓度进行精确定量，进行进一步基因芯片检测。将片段化标记后的样品加入对应型号芯片，放入GeneChip Hybridization Oven 645杂交炉，到达指定时长后使用基因芯片洗脱工作站GeneChip Fluidics Station 450按对应Protocol进行洗染，使用3000 7G的基因芯片扫描仪(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)对阵列进行扫描。扫描仪通过捕获荧光信号获得每个探针的信号值，生成CEL文件。使用R软件包(R version 3.4.4)进行原始数据数归一化和标准化处理，再对所有mRNA进行差异表达分析，得到差异表达的mRNA。

差异表达mRNA功能分析及关键mRNA选择：我们在DAVID(Annotation, Visualization and Integrated Discovery https://david.ncifcrf.gov/)网站进行GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，对差异mRNA进行功能注释和分类，构建蛋白互作网络关系图，并筛选出前20名的关键mRNA，找到基因间相互关系。在oncomine(https://www.oncomine.org/resource/login.html)中验证该20个mRNA在肺癌中的表达差异，提取出同时在oncomine中具有表达差异的mRNA，分析其在肺癌中与患者生存的关系。

三、统计方法

我们采用 R (http://www.bioconductor.org/)软件中的“gcrma”包对基因芯片CEL文件进行归一化和标准化处理。再使用“limma”包对所得到的数据进行差异表达分析。良恶性胸腔积液中的差异表达mRNA根据t检验的方法，设定FC(fold-change)≥2且p≤0.05为统计学差异。前期研究中[6]通过聚类分析显示两组标本间mRNA表达谱的差异。并采用火山图的方式展现出两组差异表达的mRNA。使用Cytoscape绘制蛋白互作网络关系图。使用在线工具http://gepia.cancer-pku.cn/对有差异的基因进行生存分析。

结 果

一、良恶性胸腔积液患者一般资料比较

我们收集6例胸腔积液患者入组，其中3例为肺腺癌合并胸膜转移，3例为结核性胸腔积液，所有患者均经组织病理学确诊。6例患者的人口学特征(见表1)。

表1 入组患者的人口学特征

二、两组患者中差异表达的mRNA及GO、KEGG分析

基因芯片(Clariom D Human Array)用于检测良恶性胸腔积液mRNA表达谱。经统计分析，共得到差异表达的mRNA1716个，其中上调mRNA1098个，下调mRNA618个(FC≥2.0 and p < 0.05)。前期研究[6]中对差异表达的mRNA进行GO富集分析发现，所有差异表达的mRNA生物学过程主要集中在细胞迁移、信号转导、细胞黏附、T细胞活化、细胞表面受体信号通路等；其所参与的细胞组分，主要有细胞外外泌体、浆膜、原生质膜的组成部分、细胞表面、黏着斑等；另外其参与的分子功能多集中在蛋白结合、肌动蛋白丝绑定、整合素结合、钙粘蛋白结合及细胞粘附、细胞黏附分子结合等。KEGG分析提示差异mRNA功能，主要集中在以下信号通路：肿瘤信号通路、细胞外基质受体相互作用、细胞黏附分子、PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路、肿瘤中的蛋白聚糖、黏着斑、T细胞受体信号通路等。

三、构建蛋白互作网络，筛选关键基因：我们利用DAVID网站对差异表达mRNA构建蛋白互作网络关系图(图1)，并筛选出前20个关键基因：APP、CKAP4、LAMB1、LAMC1、SDC2、GPC3、APLP2、RCN1、WFS1、BMP4、SPP1、MSLN、IGFBP3、F5、CSF1、CALU、IGFBP7、CYR61、GOLM1、PDIA6，相互关系图(图2)。其中LAMC1、SPP1、IGFBP3、F5四个基因参与不同KEGG通路(表2)。我们目前无大样本临床资料及胸水标本进行生存分析，考虑我们所收录的恶性胸腔积液均为肺癌胸膜转移，故我们在http://gepia.cancer-pku.cn/网站利用肺癌数据对该4个基因做生存分析，结果显示该4个基因的生存曲线均有统计学差异(图3)，3个上调基因(LAMC1、SPP1、IGFBP3)的高表达及下调基因F5的高表达提示较短的生存时间，预后不良。

图1 差异表达mRNA蛋白互作网络关系图

图2 关键mRNA蛋白互作网络关系图

表2 关键mRNA参与的KEGG信号通路

图3 LAMC1(A)、SPP1(B)、IGFBP3(C)、F5(D)在肺癌患者中的生存曲线LAMC1、SPP1、IGFBP3、F5在肺癌患者中高表达和低表达总生存时间比较

讨 论

胸腔积液是临床上常见的疾病，在肺癌中常常以首发症状出现，合并胸腔积液多提示III～IV期肺癌[7]。胸腔积液的诊断首先依据Light氏标准和胸水生化等明确胸水性质为渗出液还是漏出液，如果是渗出液，则需进一步完善胸水肿瘤系列、胸水沉淀病理以及微生物检测等鉴别良恶性胸腔积液，对一些难以鉴别的胸腔积液，甚至需要行胸腔镜胸膜活检术明确。整个诊断过程耗时、耗力，因此临床上需要灵敏性及特异性更高的生物标志物鉴别良恶性胸腔积液。对于恶性胸腔积液的治疗在临床上仍然是个难点，在分子层面探索胸腔积液的生成机制，为胸腔积液的治疗提供有利的线索。在我们的研究中发现LAMC1、SPP1、IGFBP3、F5与肺癌患者的预后相关，本文重点分析了LAMC1、SPP1在恶性胸腔积液中的作用。

LAMC1(laminin γ1)是层黏连蛋白家族中的一员，是肿瘤微环境中一部分，调节细胞外基质，参与细胞的分化、迁移、粘附[8]。已有研究[9-11]显示LAMC1在脑膜瘤细胞、前列腺癌、子宫癌等多种肿瘤中表达增高，促进癌细胞的转移。Ye GuanXiong[12]等研究发现LAMC1下调使 AKT通路失活从而调节PKM2的表达，进而抑制肝癌细胞转移和Warburg效应。目前LAMC1对肺癌的影响鲜有报道，本研究中发现恶性胸腔积液中LAMC1明显升高，我们推测LAMC1同样影响着恶性胸腔积液的进展及预后。

分泌性磷蛋白(secreted phosphoprotein l，SPP1)是一种分泌性磷酸化糖蛋白，属于细胞外基质(extracell matrix，ECM)，该蛋白参与破骨细胞粘附于骨矿化基质的过程，可促进细胞的黏附和迁移，大量研究证实[13-14]spp1在多种浸润性癌中发挥重要作用，如乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌等。一项989例NSCLC的研究[15]显示SPP1过表达与NSCLC预后不良有相关性。另一项研究亦揭示SPP1可促进小细胞肺癌的增殖活力，抑制凋亡和自噬[16]。有实验检测了肿瘤和宿主来源的SPP1在MPE形成中的影响，结果发现SPP1在恶性胸腔积液中起到以下重要作用，SPP1协同促进胸膜积液和胸膜内癌扩散; SPP1还可以产生血管内皮生长因子非依赖性高通透性作用; 宿主SPP1诱导巨噬细胞进入胸膜转移瘤内并促进肿瘤血管生成，而肿瘤SPP1在体内抑制癌细胞凋亡; 肿瘤和宿主SPP1通过不同途径影响胸膜TNF、基质金属蛋白酶-2、IL-6含量，此外 SPP1还可以激活肺癌细胞中的NF-kB通路[17]。有研究使用ELISA检测良恶性胸腔积液中的SPP1表达水平，发现恶性胸腔积液中SPP1表达明显升高，胸腔积液中SPP1表达量诊断MPE的准确性为71.5%(95%CI：64%～80%)，我们试验中采用基因芯片技术同样检测到恶性胸腔积液中SPP1表达水平明显高于良性胸腔积液，证实了SPP1参与恶性胸腔积液的发生、发展。

在我们的试验中发现多种mRNA存在表达差异，其中最为显著且在肺癌中与生存相关的mRNA有LAMC1、SPP1、IGFBP3、F5，其他研究中也发现LAMC1、SPP1在恶性肿瘤中存在表达差异，尤其是SPP1在多项研究中发现恶性胸腔积液中表达水平明显增高，作为诊断指标可以提高恶性胸腔积液诊断准确性，我们的研究中，入组样本量偏少，且入组样本都是肺腺癌胸膜转移合并恶性胸腔积液，不能覆盖肺癌其他病理类型，在后续研究中增大样本量，重点研究上述4个mRNA的表达水平，根据大样本数据可以联合多项指标通过简便快速的方法诊断出恶性胸腔积液。