淋巴吻合培训动物模型的制备

卢鸿瑞 谢庆平

随着显微外科技术的发展，显微淋巴吻合技术在临床上被广泛开展，但大部分显微外科医师并没有熟练的淋巴管解剖和吻合经验。简便实用的淋巴吻合动物培训模型是广泛开展此类手术的关键。因目前缺乏一个理想的淋巴吻合的动物模型，本研究拟制备一种取材方便、淋巴管染色清晰的用于培训淋巴吻合技术的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

20 只SPF 雄性白来航鸡，2～3 月龄，体质量1 800～2 500 g。实验前，将实验动物饲养于空调恒温室内（24 ℃～25 ℃），保证温度湿度稳定、环境干净、通风条件良好，以标准条件常规饲养1 周时间。

亚甲蓝注射液2 mL/20 mg（济川药业集团有限公司）；100 g/L 硫化钠；生理盐水；75%医用乙醇；聚维酮碘。

手术显微镜（ZEISS OPMI Vario S88）；一次性使用剖切刀（北京博海康源医疗器械有限公司）；固定板；持针钳；显微剪；手术刀；线剪；尼龙单丝11-0/12-0 线带缝合针（上海浦东金环医疗用品股份有限公司）；医用备皮刀（扬州市华威医疗器械有限公司）；数显游标卡尺（Mitutoto，日本）。

1.2 方法

1.2.1 分组

按培训要求，受训人员每组2 人，一人主刀，一人协助，进行交换重复多次的练习，每3 组随机挑选20 只白来航鸡，进行动物模型制备和显微操作培训。

1.2.2 实验动物术前准备和染色处理

抓取健康的实验动物，进行操作前准备。取亚甲蓝注射液（美蓝染色剂）2 mL，从动物眼眶上缘注入脑组织内，进行染色处理；染色后结扎动物的颈根部，使得实验区域的静脉充盈，经眼眶向颅内注入5～10 mL 空气处死实验动物。使用10 mL 硫化钠对鸡的颈部进行干性脱毛处理，脱毛后采用塑料袋和胶带分别密封包扎鸡的头部及体部，放置试验台固定，使用聚维酮碘消毒后备用（图1）。

图1 动物的培训前准备Fig.1 Pre-training preparation of animals

1.2.3 显微镜下分离和吻合淋巴

采用11 号手术刀片在动物颈部沿切口线行8 cm 纵行切口，切开皮肤及皮下筋膜组织，采用2-0丝线多点定位牵开皮肤及皮下组织，沿着颈动脉鞘寻找被亚甲蓝染色后的淋巴管。在20 倍显微镜下解剖分离淋巴管、淋巴结和脂肪内静脉，并用11-0/12-0 线进行淋巴管静脉端端吻合、端侧吻合和淋巴结静脉吻合的操作练习（图2）。

图2 淋巴管的解剖分离Fig.2 Dissection of lymphatic vessels

1.2.4 淋巴管静脉吻合设计

淋巴管静脉吻合术（LVA）是指将淋巴管离断后的远心端与管径相近的静脉管近心端行端端吻合或与静脉管行端侧吻合的方法。

淋巴管与静脉的端端吻合：解剖显露染色的淋巴管及邻近的口径相似的静脉，调整吻合张力后在16 倍显微镜下切断淋巴管和静脉管，对淋巴管近心端不予处理，静脉管远端结扎止血。采用数显游标卡尺分别测量静脉和淋巴管的口径后，在吻合口处修剪淋巴管、静脉管管口。使用带针的11-0 或12-0显微吻合线在6 点钟处首先定位缝合，对淋巴管管径0.2 mm 及以下者在2 点钟处和10 点钟处再缝合2 针固定，淋巴管管径0.2 mm 以上者在0 点、3 点、9点钟处再缝合3 针固定。要求边距及针距均匀，轻微外翻打结。

淋巴管与静脉管的端侧吻合：适用于解剖显露的淋巴管和静脉管管径相差较大时。在静脉管朝向淋巴管侧采用显微剖切刀切开静脉管壁0.3 mm，在6 点钟处首先定位缝合淋巴管口与血管后壁，根据淋巴管口径的不同采用不同的缝合法。对淋巴管径0.2 mm 及以下者采用3 点吻合法，分别在2 点钟处和10 点钟处再缝合2 针行端侧吻合；淋巴管管径在0.2 mm 以上时采用4 点吻合法，分别在0 点、3点、9 点钟处再缝合3 针行端侧吻合（图3）。

图3 淋巴静脉吻合术Fig.3 Lymphatic vein anastomosis

1.2.5 淋巴结静脉吻合设计

在20 倍显微镜下解剖分离淋巴结与相邻的静脉管，根据静脉管口径选择吻合方式：静脉管口径小于0.3 mm 时采用远端结扎、近端端端吻合的方式进行，淋巴结一侧切除1/4～1/3 的淋巴结组织，将修剪后呈鱼口状的静脉管近心端端口与淋巴结的创面使用带针的11-0 或12-0 显微吻合线进行4 针法方式固定，分别于0 点、3 点、6 点、9 点钟处缝合；当静脉管径大于0.3 mm 时，采用显微剖切刀切开面向淋巴结的静脉管壁0.3 mm，淋巴结一侧切除1/4～1/3的淋巴结组织，将静脉侧壁口与淋巴结创面使用带针的11-0 或12-0 显微吻合线进行4 针法方式固定，分别于0 点、3 点、6 点、9 点钟处缝合。

1.2.6 培训和观察情况

吻合完毕，采用血管通畅实验的方法，观察吻合口通畅情况，并及时记录异常情况。吻合口通畅性检验：①采用由远至近淋巴管勒血实验检查静脉血管内的血液是否被推移；②采用由近至远静脉管勒血实验观察静脉管内血液是否通过吻合口进入淋巴管。通过多次检验判断淋巴管和静脉通畅程度，主刀和助手进行对换，反复训练吻合技术（图4）。

图4 观察吻合口通畅情况Fig.4 Observation of the patency of anastomosis

2 结果

2.1 一般情况观察

初级培训要求：①熟练掌握动物处理、亚甲蓝注射液染色、处死、备皮等操作，熟悉固定解剖，寻找染色淋巴管及淋巴结、静脉。②进行淋巴管与静脉吻合20 次。

高级培训要求：在初级培训要求的基础上，熟练掌握各种管径和各种方法的淋巴管/淋巴结静脉吻合，累计吻合次数60 次，吻合口即时通畅率达80%。

2.2 培训效果评价

显微外科淋巴管和静脉吻合学习曲线如图5 所示，操作时间和通畅吻合口数量呈正相关。

图5 淋巴管静脉吻合学习曲线Fig.5 Learning curve of lymphatic vein anastomosis

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的癌症[1]，每5 例乳腺癌术后女性中就有1 例会在淋巴结切除术后出现上肢淋巴水肿[2]。肢体淋巴水肿除导致肢体肿胀和功能障碍外，也影响淋巴相关的免疫反应的调节，导致皮肤软组织炎症，使得患者感染丹毒的风险升高，严重影响生活质量。乳腺癌根治术的一般标准程序是切除肿瘤区域所有的淋巴结，虽然改进后采用前哨淋巴结活检和选择性淋巴结清扫术，但乳腺癌根治术后仍有4%～10%的淋巴水肿发生率[3]。下肢淋巴清扫后也很容易导致下肢淋巴水肿，大约20%的患者在腹股沟淋巴结清扫术后发生淋巴水肿[4]。

1962 年，首次提出在淋巴管和静脉之间建立吻合，将淋巴液提前分流到静脉系统，可用于治疗肢体慢性淋巴水肿[5]。1976 年，O'Brien 等[6]的临床报告证实了这种方法的临床有效性，淋巴显微外科领域有了重大突破。此后，随着超级显微外科吻合技术的推广，0.3～0.8 mm 的血管吻合技术日趋成熟，这也增加了淋巴管静脉吻合的可靠性。据报道，使用直径0.5～0.7 mm 的淋巴管和直径0.7～1.0 mm 的真皮下静脉进行淋巴管静脉吻合，术后随访结果良好，此方法逐渐被认为是治疗慢性淋巴水肿的有效方法[7-8]。但大部分显微外科医师并没有熟练应用荧光示踪技术和吻合淋巴管和静脉的经验，随着超级显微外科淋巴静脉吻合技术的培训和推广，临床淋巴水肿的治疗水平将得以推动。

因此，建立简便实用的淋巴吻合技术培训动物模型是广泛开展此类手术的关键。文献报道的第一个稳定的淋巴水肿动物模型是Olszewski 等[9]于1968 年在狗身上建立的。他们通过创新性的周向切除法，对浅部和深部淋巴管进行双层切割，建立了第一个可靠和可重复的获得性淋巴水肿模型。之后，Das 等[10]于1981 年在此基础上结合放射线照射后获得比较可靠的淋巴水肿模型，基本可以诱发动物肢体淋巴水肿，但其需要有特殊的途径和较为复杂的制备过程。之后，这种周向切除淋巴管的方法被应用于兔耳[11-12]和啮齿动物后肢模型[13-14]。也有研究制作了啮齿动物尾巴模型[15]。

但此类动物模型都未得到广泛的推广，目前报道的淋巴显微吻合技术培训使用的动物模型都存在以下缺陷：狗的模型与人体最相近，但捕捉和饲养困难，费用高，操作难度大；兔耳组织极薄，层次很多，不容易寻找到淋巴管，术后动物容易感染致死；大白鼠的动物模型虽然容易制作，但以急性淋巴水肿模型为主，难以获得比较可靠的慢性淋巴水肿模型，且大白鼠血管淋巴管细小，难以进行以培训为目的的淋巴静脉吻合。因此，目前仍未有一种可被广泛应用的淋巴吻合培训动物模型。

我们根据目前淋巴水肿动物模型制备的优缺点，提出了使用鸡的颈部淋巴管静脉吻合模型的设想，经过实践，取得了可靠的淋巴管静脉吻合的培训效果，受训人员经过2～4 周的培训，获得80%的吻合口通畅率。该培训结果具备培训周期短、培训费用低、培训场地建设容易等特点；该动物模型的制备具备可靠、稳定、制作简单的优点。

在本组动物模型制备中，我们采用亚甲蓝染色剂通过脑组织内染色的方法在实验区获得了清晰的淋巴管显影，同时实验区的染色污染较轻，为淋巴静脉吻合技术培训创造了有利条件，是目前淋巴管静脉吻合培训的可靠动物模型之一。

4 结论

鸡是制备淋巴染色及淋巴静脉吻合培训的一个比较适合的动物模型。其优点是技术操作可靠稳定，动物获取成本低，制备过程简单，可以较好模拟临床上淋巴管静脉吻合的场景，是显微外科医师超级显微外科吻合技术培训的实用模型。