Supervilin通过Wnt/β-catenin通路调控斑马鱼胚胎集中延伸运动

胡丽珠，赵成刚，范俊启，杨浩然，张尚荣，陈学冉，方志友

Svil蛋白是Villin/Gelsolin蛋白超家族的一员。目前，哺乳动物中已鉴定出5种亚型[1]。研究[2-5]发现，Svil的主要功能是调节微丝骨架与膜的相互作用，调控细胞存活、增殖、分裂、分化，以及伪足的形成等。然而，Svil在胚胎发育中的作用尚不清楚。

在胚胎发育的早期阶段，细胞分裂和迁移是最重要的两大事件。其中，集中延伸运动(convergence and extension movement， C&E)是原肠期的一个重要迁移事件[6-7]。Wnt/β-catenin通路在C&E中起着重要作用，其靶基因主要包括bozozok(boz)、chordin(chrd)、dickkopf1 (dkk1)、squint(sqt)，Wnt/β-catenin通路异常会导致胚胎发育异常[8-9]。该实验鉴定出斑马鱼中存在的两个Svil亚型，其中，Svila与人类Svil1同源性较高，但Svila在斑马鱼胚胎发育过程中的作用尚不清楚。该文旨在探究Svila对斑马鱼胚胎发育的影响以及对原肠胚期C&E的调控机制。

1 材料与方法

1.1 Svil氨基酸序列同源分析使用Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)软件，鉴定斑马鱼的两种Svil亚型，Svila[NP 001030338.2]和Svilb[XP 021323763.1]，与人类的4种Svil1[NP 003165.2]、Svil2[NP 068506.2]、Svil3[NP 001310528.1]、Svil4[NP 001310529.1]，进行氨基酸序列比对，分析种属间同源性。

1.2 斑马鱼培养和Morpholinos注射将斑马鱼(Danio rerio) AB株置于28.5°C的标准实验室条件下培养[10-11]。次日清晨产下斑马鱼卵，收集、分类。根据斑马鱼Svil序列，分别针对翻译起始点和外显子6与内含子7之间的剪接序列设计反义morpholinos (MO)，序列如下：CAATTCGCTCCTTCCTGTTCATGTC (MOATG，针对Svila的起始翻译位点)；ATGAAGAGAAGAGCACCCGTGTCT (MOsb，针对Svila外显子6与内含子7之间的剪接序列)；以及对照 MO：ATcAAcAGAAcACTCACgCcTGTC (Con MO, 随机序列) 。将8 ng MO 注射到斑马鱼胚胎的1～2细胞期，以敲低斑马鱼胚胎Svila的表达。

1.3 RT-PCR使用TRIzol提取斑马鱼胚胎背侧组织总RNA，以获得的RNA为模板，使用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(TransGen )进行逆转录，并获得cDNA。设计SVILa上下游引物，以获得的cDNA为模板进行聚合酶链式反应(PCR)，将反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得目的基因条带。Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因RT-PCR步骤同上，检测下游靶蛋白mRNA水平，各下游基因引物如表1所示。

表1 基因引物

1.4 原位杂交设计地高辛(Digoxin)标记的cDNA反义探针。利用正、反向引物，通过反转录PCR扩增基因片段，将扩增得到的片段克隆到pCS2+载体(美国Invitrogen公司)中，采用NotI线性化，Sp6 RNA聚合酶转录获得地高辛标记的反义探针。60℃变性，56℃退火。将胚胎固定，在缓冲液中与探针进行杂交反应。洗涤、封闭，与抗荧光素碱性磷酸酯酶结合物保温1 h，再次洗涤，置于暗处显色4～24 h，并于光学显微镜下观察结果。

1.5 Western blotWestern blot检测β-catenin的核定位情况。利用细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒(P0027，上海碧云天生物技术公司)，分别收集胞质和胞核中的总蛋白[12]。加入SDS混合均匀，100℃煮样10 min；SDS-PAGE凝胶电泳分离，转移到NC膜上；用5%脱脂牛奶封闭1 h，PBS洗3次，每次5 min；加入一抗(β-catenin，1：1 000；美国CST公司， #8480)，4℃过夜孵育；PBS洗3次，每次5 min，加入HRG标记的IgG二抗(1：5 000；美国CST公司)室温孵育40 min，洗膜；用ECL化学发光进行显色，组蛋白Histon3和β-tubulin分别作为细胞核和细胞质的内参对照。

2 结果

2.1 斑马鱼Svil与人源Svil同源性分析斑马鱼含有两种Svil亚型，分别为Svila和Svilb，人类有五种Svil亚型，分别为Svil1、Svil2、Svil3、Svil4和Svil5。利用Clustal Omega在线工具进行氨基酸序列比对分析，发现它们在进化上具有相关性(图1)。使用DNAman软件分析显示斑马鱼Svila和人类Svil1在序列上具有56.06%的相似性，尤其是斑马鱼Svilaaa270～427与人类Svil1 aa265～411。然而，Svilb和人类Svil1具有32.70%的相似性(图1)，这表明斑马鱼Svila是人类中Svil1的同源蛋白。

2.2Svila在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式分析使用RT-PCR分别检测256细胞期、胚盾期、尾芽期、体节期、24 hpf期、36 hpf期、48 hpf期的Svila表达情况，显示Svila为母源性表达，且表达量随着早期胚胎发育的进行呈上升趋势(图2A)。利用原位杂交技术检测斑马鱼胚胎的30%外包期、胚盾期、75%外包期、18 hpf期和36 hpf期Svila的表达，结果显示在斑马鱼胚胎发育的早期，Svila在整个胚层均有表达，而在胚胎发育后期，Svila主要集中在头部和体节处表达(图2B)。这些结果提示Svila可能调控斑马鱼的早期胚胎发育。

2.3 斑马鱼Svila敲低胚胎表型分析为了探索Svila在斑马鱼胚胎发育过程中的功能，分别注射了MOsb(针对SvilamRNA剪切)和MOATG(针对Svila起始翻译位点)敲低斑马鱼中Svila的表达。与注射对照MO(Con MO)的胚胎相比，注射MOsb的斑马鱼胚胎在48 hpf阶段出现了明显的体轴弯曲。对照组标准差为29±1，敲低组标准差为24±6，每组样本总数均为30 (图3B)；注射MOATG的斑马鱼胚胎在48 hpf阶段也出现了明显的体轴弯曲，对照组标准差为48±2，敲低组标准差为37±13，每组样本总数均为50 (图3C)。暗示Svila基因的敲低可能会导致斑马鱼胚胎早期原肠胚运动受阻。

2.4 敲低Svila抑制斑马鱼胚胎集中延伸运动在脊椎动物胚胎发育的早期，集中延伸运动和背腹侧(dorsab-ventral， DV)轴的形成是最重要的两个事件。为了探究Svila是否参与了这两大事件，课题组通过检测30%外包期斑马鱼胚胎腹侧标志物Gata2、Eve1和背侧标志物Chordin的表达情况探究Svila对背腹侧轴形成的影响。与对照组相比，注射MOsb的胚胎DV轴形成没有发生明显异常。对照组3个基因标准差分别为15±0、15±0、14±1；敲低组3个基因标准差分别为13±2、13±2、12±3(样本总数均为15)。但是，敲低Svila组胚胎头部和尾部之间的夹角显著大于对照组，对照组标准差为15±0，敲低组标准差为14±1(每组样本总数均为15)。这表明Svila的敲低抑制了斑马鱼胚胎的集中延伸运动。见图4。

图1 斑马鱼Svil(Svila和Svilb)与人类4种Svil1(Svil, Svil2, Svil3和Svil4)氨基酸序列比对结果

图2 斑马鱼Svila早期胚胎中表达模式

图3 敲低Svila斑马鱼胚胎发育至48 hpf表型统计分析

图4 敲低Svila斑马鱼早期胚胎背腹轴的形成及集中延伸运动的影响

2.5Svila可能是通过Wnt/β-catenin通路调控斑马鱼胚胎发育为了检测Svila是否通过影响Wnt/β-catenin通路调控斑马鱼胚胎发育，进行核质分离实验。分别收集胞质蛋白和胞核蛋白，随后使用Western blot实验分析。结果显示，与对照组相比，Svila敲低后细胞核中β-catenin含量明显降低(图5) (P=0.000 6、0.000 2，F=12.42、7.785)，差异有统计学意义。在细胞质内，敲低Svila组与对照组相比，β-catenin表达也下调(P=0.004 6、0.000 3，F=792.9、345)，差异有统计学意义。组间分析结果显示对照组之间P值为1，无明显差异；注射MOsb组P=0.000 4，F=233.1，差异有统计学意义；注射MOATG组P<0.000 1，F=161.9，差异有统计学意义。同时，RT-PCR结果也显示Svila敲低组中Wnt/β-catenin信号通路的靶蛋白boz、dkk1和sqt的表达均发生下调(图5C)，boz组P=0.001 2，0.015 0；dkk1组P=0.000 2、0.001 3；sqt组P=0.001 3、0.005 0，chrd组P=0.393 3、0.285 4。综上所述，Svila主要通过Wnt/β-catenin信号通路调控斑马鱼胚胎的集中延伸运动。

图5 敲低Svila将抑制Wnt/β-catenin信号通路

3 讨论

Svil作为细胞微丝骨架结合蛋白，通过与肌动蛋白和肌球蛋白相互作用调节细胞骨架动力学，通过影响其他蛋白的定位和分布调控细胞内多种活动[13]。例如，Svil调控伪足小体的形成[5]，调控细胞存活、细胞分裂、细胞迁移等[3-4, 14]。在胚胎发育过程中，细胞分裂、分化和迁移是在不同阶段以不同比例发生的重要事件。在原肠胚期，细胞的正确定位和各个组织的正常发育离不开细胞迁移。

Svil是Gelsolin蛋白家族的一员[1]。据报道，这个家族的其他成员在胚胎发育的特定阶段发挥着不同的作用。Svil在细胞水平上的功能研究的较多，但其在胚胎发育中的作用尚不清楚。本研究结果表明，Svila敲低抑制了斑马鱼胚胎的集中延伸运动，Svila表达的下调会影响β-catenin在细胞核上的定位，导致β-catenin的靶基因boz、dkk1、sqt等表达异常。综上所述，Svila的敲低降低了细胞迁移能力，从而阻断了斑马鱼原肠胚期的集中延伸运动，其作用机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来实现的。