免疫检查点VISTA分子对脓毒症小鼠免疫炎症反应的调节作用

陶天柱，张国荣，杨晓明，郭 青 ，刘 珺

脓毒症是机体对感染的免疫反应失控引起的致命性器官功能损害，是危重病患者死亡的重要原因[1]。流行病学研究[2]显示全球每年因脓毒症死亡的病例达到600万，严重脓毒症的病死率高达25%～30%。脓毒症早期机体在病原微生物和代谢产物刺激下，产生大量的促炎性炎症因子和氧自由基。随着脏器保护和替代治疗技术的不断完善，脓毒症患者多能度过过度炎症反应期，而进入长期的免疫抑制状态[3]。V区Ig抑制子(V-domain Ig suppressor of T-cell activation, VISTA)，也被称为程序性死亡因子同源物(programmed death 1 homolog, PD-1H)，主要表达于T淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞表面。既往研究[4]发现，VISTA分子在抑制淋巴细胞过度活化和维持免疫稳态的过程中发挥重要作用。该文拟通过尾静脉注射抗VISTA抗体(MH5A)，探讨在体激活VISTA信号通路对脓毒症小鼠免疫功能的调节作用及治疗价值。

1 材料与方法

1.1 脓毒症小鼠模型建立雄性8～12周龄的C57BL/6小鼠共80只，体质量20～30 g，由海军军医大学实验动物中心提供。小鼠适应性饲养1周，于术前12 h禁食，随机数字表法分为盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture, CLP)组和假手术(Sham)组。经腹部正中切口暴露盲肠，沿距离远端1 cm处结扎，使用18G穿刺针对穿盲端，轻轻挤出少量肠道内容物，将盲肠还纳腹腔后间断缝合腹膜和皮肤，皮下注射生理盐水1 ml。假手术组仅暴露盲肠，不给予结扎或穿孔操作。本实验中的动物处理方法符合动物伦理学标准，经空军特色医学中心伦理委员会审查批准。

1.2 主要试剂别藻蓝蛋白(allophycocyanin, APC)标记的抗小鼠CD4抗体， 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的抗小鼠CD8抗体，藻红蛋白(phycoerythrin, PE)标记的抗小鼠VISTA抗体，抗VISTA激动型抗体(克隆号：MH5A)和同型对照抗体(克隆：HTK888)均购自美国Biolegend公司。小鼠细胞因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)、IL-1β和干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)的ELISA试剂盒均购自美国BD Bioscience公司。脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)检测试剂盒购自美国Chemicon公司。

1.3 单克隆抗体注射治疗将CLP小鼠随机分为抗体治疗组(MH5A)和同型对照抗体组(Isotype)，每组8只，分别于CLP术前2 h给予治疗组尾静脉注射100 μg抗VISTA抗体，对照组100 μg同型对照抗体。

1.4 流式细胞术检测T淋巴细胞VISTA表达变化收集CLP或Sham术后24 h的外周血和脾脏，研磨小鼠脾脏制备单细胞悬液，裂红液处理后离心去上清液。PBS重悬制备单细胞悬液，加入APC标记的CD4抗体，FITC标记的CD8抗体和PE标记的VISTA抗体，避光孵育30 min，PBS洗涤去上清液后，上机检测。

1.5 ELISA检测小鼠外周血细胞因子表达收集小鼠外周血离心取上清液，按照ELISA试剂盒操作步骤逐步加样检测细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ的表达。

1.6 小鼠腹腔和外周血细菌负荷测定收集小鼠外周血稀释至103或105倍，制备100 μl悬液；使用2 ml无菌PBS灌洗小鼠腹腔，收集灌洗液稀释105或107倍，制备悬液。将稀释后的血和灌洗液均匀涂抹至琼脂糖平板，于37℃温箱孵育24 h后计数菌落形成单位(CFU)。

1.7 TUNEL染色检测脾脏细胞凋亡制备小鼠脾脏石蜡切片，缓冲液孵育后，加入末端脱氧核苷酸转移酶和dUTP地高辛染色。37℃孵育1 h后停止反应。清洗切片，然后加入抗地高辛过氧化物酶溶液。切片用DAB/H2O2染色，双苯甲酰胺反染。高倍显微镜下计数10个视野中染色阳性的细胞平均数。

1.8 小鼠7 d生存期观察将小鼠随机分为Sham组、CLP组、CLP+抗VISTA抗体组和CLP+对照抗体组，每组12只。抗VISTA抗体组给予抗VISTA抗体100 μg，对照抗体组给予同型对照抗体100 μg，其余组别给予100 μl生理盐水，观察术后7 d各组小鼠的生存期。

2 结果

2.1 脓毒症小鼠淋巴细胞VISTA表达变化如图1和表1所示，sham和CLP组小鼠外周血和脾脏中CD4+T细胞或CD8+T细胞均表达丰富的VISTA分子，但各组间VISTA平均荧光强度(mean fluores-cence intensity，MFI)比较差异均无统计学意义。

图1 脓毒症小鼠外周血和脾脏T淋巴细胞VISTA表达变化MFI：平均荧光强度

表1 脓毒症小鼠外周血和脾脏T淋巴细胞VISTA表达变化

2.2 MH5A抗体治疗可以显著降低脓毒症小鼠的死亡率分别于术前2 h在体给予抗VISTA抗体或同型对照抗体，观察各组小鼠的7 d生存期，结果显示：CLP组为16.7%(2/12)，CLP+抗VISTA抗体组66.7%(8/12)，组间差异有统计学意义(P=0.01)。见图2。

图2 抗VISTA抗体改善脓毒症小鼠7 d生存期与CLP组比较：*P<0.05

2.3 抗VISTA抗体抑制促炎性反应，并降低细菌负荷如表2所示，与CLP组相比，抗体治疗组促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ的表达水平降低，差异有统计学意义；同时，外周血和腹腔灌洗液培养后细菌集落的数量减少，提示抗体治疗组小鼠的细菌清除能力改善。

2.4 抗VISTA抗体减少脓毒症小鼠脾脏淋巴细胞凋亡TUNEL染色显示，CLP术后24 h小鼠脾脏中的凋亡细胞数增加(图3)，差异有统计学意义。与对照组相比，抗VISTA抗体治疗后脾脏中的细胞凋亡数量减少，差异有统计学意义(30 123 ± 6 400vs45 482 ± 8 652，P=0.03)，提示抗VISTA抗体可以抑制淋巴细胞的凋亡。

3 讨论

随着脓毒症病理生理机制研究的不断深入，调控免疫炎症紊乱已经成为治疗脓毒症的新方向。既往研究[5]证实，脓毒症时淋巴细胞的数量、功能和表型均发生显著变化，且与患者的病情严重程度和预后密切相关。免疫检查点分子是调节淋巴细胞的功能的重要靶点，阻断程序性死亡分子(PD-1)/程序性死亡分子受体配体(PD-L1)或细胞毒性T细胞相关抗原(CTLA-4)都可以改善淋巴细胞的功能，对脓毒症小鼠发挥保护作用[6-8]。本文通过在体给予MH5A抗体显示，调控VISTA通路可以减少淋巴细胞的凋亡，抑制机体炎症反应，改善细菌清除能力，从而改善脓毒症小鼠生存期。

多项尸检研究[9]显示，在脓毒症死者的诸多脏器中观察到免疫细胞如T细胞、树突状细胞和B细胞的大量凋亡，且免疫细胞中的免疫检查点分子表达上调。与其他B7家族的检查点分子不同，VISTA在对照组小鼠淋巴细胞中表达丰富，而CLP术后24 h未见显著的升高，提示VISTA信号通路在免疫炎症反应的启动阶段即可发挥明显的调节作用。

表2 抗VISTA抗体降低脓毒症小鼠外周血细胞因子和细菌负荷

图3 抗VISTA抗体抑制脓毒症小鼠脾脏淋巴细胞凋亡 TUNEL染色×400a:Sham组; b:CLP组; c:CLP+抗VISTA抗体组; d:CLP+Isotype组; 与CLP组比较：*P<0.05

Wang et al[4]发现，在未活化的淋巴细胞中加入重组VISTA Ig分子片段，对淋巴细胞的凋亡没有显著影响。课题组在本研究中观察到激活VISTA信号通路可以减少CLP小鼠脾脏淋巴细胞的凋亡，但在假手术组给予MH5A抗体对细胞凋亡并无显著影响(结果未报道)，提示VISTA对淋巴细胞凋亡的调节作用与细胞自身的活化状态可能相关。MH5A抗体减少淋巴细胞凋亡可能还受到其他因素的间接影响，如促炎性细胞因子TNF-α的分泌减少和细菌负荷的降低。

脓毒症早期过度的炎症反应是导致免疫细胞凋亡和重要脏器直接损害的关键因素。本研究观察到MH5A抗体可以显著降低促炎性细胞因子的产生，其可能的机制包括以下3个方面：① 淋巴细胞细胞因子分泌减少。大量研究[4，10-12]证实，VISTA是负性调控T淋巴细胞免疫反应的靶点，利用重组VISTA Ig分子片段或激活型抗VISTA抗体活化信号通路可以负性调节淋巴细胞的功能，抑制细胞因子如IL-2和IFN-γ的产生。而IL-2和IFN-γ等细胞因子在单核巨噬细胞过度活化的过程中均发挥一定作用，切断T细胞来源细胞因子的产生可以间接抑制单核巨噬细胞的活化，降低全身的炎症反应。②VISTA对髓样细胞的直接作用。VISTA可以同时表达于淋巴细胞和髓样细胞，发挥受体和配体的双重作用，但VISTA对髓样细胞的调节作用目前研究结论尚不一致。Bharaj et al[13]在HIV感染的患者中研究发现，单核细胞过表达VISTA后可以自发性分泌促炎性细胞因子如IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β。不同的是，Han et al[14]发现，与淋巴细胞的调节作用相似，VISTA也可以负性调节中性粒细胞和浆细胞样DC分泌细胞因子的功能。VISTA分子对髓样细胞功能的调节作用和机制尚需进一步研究证实。③细菌负荷的降低。细菌负荷和机体炎症反应的程度可以互为因果，当细菌负荷降低时，病原微生物和代谢产物对免疫细胞的刺激减少，细胞因子的产生随之减少。理论上，VISTA抑制淋巴细胞的凋亡可以保护获得性免疫反应的能力，促进细菌的清除，降低全身和局部的细菌负荷。

综上，本研究显示免疫检查点VISTA分子是调节脓毒症免疫炎症反应的重要靶点，MH5A抗体可以阻断淋巴细胞凋亡途径，抑制炎症因子，降低细菌负荷，从而对脓毒症小鼠发挥重要保护作用。但本研究仅从在体研究着手，存在不足之处，后续研究将进一步阐明VISTA对纯化的淋巴细胞亚群和单核巨噬细胞的调节作用，为脓毒症免疫紊乱的机制研究提供借鉴，并为脓毒症的免疫调节治疗提供理论依据。