血清热休克蛋白70自身抗体在乳腺癌中的诊断价值*

梁超文 练 标 张银仙 谢长乐

广东省开平市中心医院肿瘤外科 529300

近年来，全球乳腺癌发病率呈上升趋势，是女性发病率最高的恶性肿瘤[1]。另一方面，在西方国家的乳腺癌患者中，近年来出现了死亡率下降的情况，这主要是由于对于此类疾病的早期筛查与诊断得到了普及与技术上的发展[2]。所以对于乳腺癌的早期筛查与防治是十分必要的，同时这样的措施也是有效提升乳腺癌患者生存率，提升患者保乳手术治疗可能性的关键所在。目前用于乳腺癌的检查方法，如乳房X光检查和超声等，用于早期乳腺癌筛查并不十分理想[2-4]。有研究数据指出，在早期肿瘤疾病的筛查过程中，对于患者的肿瘤相关抗原抗体进行筛查能够在一定程度上基于血清分子标志物情况对于患者实际情况进行了解。基于此，本次研究特运用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清Hsp70自身抗体在125例乳腺癌患者、33例乳腺良性肿瘤患者和127例健康体检者中的水平，探讨热休克蛋白70(Hsp70)自身抗体在乳腺癌患者中的诊断意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集我院2019年4月—2021年3月125例乳腺癌和33例乳腺良性肿瘤患者血清标本。本次研究中所有患者均未开展相应的治疗，且通过病理切片检查确诊为乳腺肿瘤患者，乳腺癌及乳腺良性肿瘤组患者均为女性，年龄40～72岁，平均年龄(51.2±14.2)岁；健康对照组患者均为女性，年龄40～72岁，平均年龄(51.3±14.1)岁；三组患者基线资料比较基本无差异(P>0.05)，同时患者对于本次研究知情且签署同意书，研究经我院伦理委员会表决通过。患者均取其晨起外周静脉血3ml进行血清制取，并低温保存。

1.2 仪器和检测试剂 酶标仪采用赛默飞世尔THERMO Multiskan FC，96孔酶标板采用海门浩天生物有限公司出产，相关试剂均采购自舟山同生生物科技公司与厦门英科新创公司。

1.3 Hsp70自身抗体的检测 对于患者血清中的Hsp70自身抗体采用酶联免疫吸附法进行检测，于96孔酶标板将Hsp70重组蛋白(PBS稀释0.8μg/ml)进行包被，保持温度4℃过夜，次日将酶标板孔内液体弃去，采用PBST对于96孔酶标板进行洗板，次数为3次，随后每孔加入200μl封闭液，封闭液主要成分为1%牛血清蛋白与PBST，37℃孵育1h；洗板，加入100μl 1∶110稀释的乳腺癌患者、乳腺良性肿瘤患者、健康对照者血清样品和质控样品(将50例乳腺癌患者的血清混合制成)，阴性对照为封闭液，阳性对照为兔抗p53多克隆抗体，所有检测均做两平行孔，37℃温箱孵育1h；洗板，加入羊抗人或羊抗兔IgG-HRP(1∶10 000稀释)，孵育1h(37℃)；洗板5次，每孔加入显色液100μl(TMB-过氧化氢)，37℃避光显色15min；加入终止液50μl，酶标仪检测各样品的A值(即A450nm-A630nm)，即测定波长为450nm、校正波长为630nm。

1.4 统计学方法 本次研究中采用SPSS22.0统计学软件进行数据分析，并采用GraphPad Prism进行ROC数据的绘制，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清Hsp70自身抗在乳腺癌患者中的水平 血清Hsp70自身抗体在乳腺癌组、乳腺良性肿瘤组和健康对照组中的OD值分别为0.110±0.078、0.077±0.048和0.061±0.037。乳腺癌组和乳腺良性肿瘤组血清Hsp70自身抗体水平高于健康对照组的水平，差异有统计学意义(Z=-7.165，P<0.001；Z=-2.065，P=0.039)；更重要的是，与乳腺良性肿瘤组相比较，乳腺癌组血清Hsp70自身抗体的水平同样显著升高，差异有统计学意义(Z=-3.084，P=0.002)，见图1。

图1 血清Hsp70自身抗体的水平箱线图

2.2 血清Hsp70自身抗体在乳腺癌中的诊断效能 根据ROC曲线分析(图2)和约登指数，当检测乳腺癌患者血清Hsp70自身抗体的cutoff值为0.060时，区分健康体检者的AUC值为0.761(95%置信区间：0.702～0.820)，敏感度为82.4%，特异度为62.2%；区分乳腺良性肿瘤患者的AUC值为0.675(95%置信区间：0.569～0.781)，敏感度为80.0%，特异度为45.5%；区分乳腺良性肿瘤患者与健康体检者的AUC值为0.746(95%置信区间：0.690～0.802)，敏感度为84.8%，特异度为56.6%。

图2 Hsp70自身抗体区分乳腺癌与不同对照组的ROC曲线

3 讨论

目前，临床上常用的乳腺癌相关血清肿瘤标志物癌胚抗原和CAl53等，对于监测复发转移和疗效评估具有很好的价值，然而，在早期乳腺癌患者，这些标志物的诊断敏感度低，只有在晚期乳腺癌才具有较高的敏感性。近年来大量研究表明，相对于正常人，在肿瘤的早期阶段，患者血清中针对肿瘤相关抗原的自身抗体水平就显著升高[5-8]，提示自身抗体在恶性肿瘤早期诊断具有潜在应用价值。更重要的是，EarlyCDT-lung是一项联合检测7种自身抗体标志物的血液检查，已经在临床上证实有助于早期发现无症状的肺癌患者，而且EarlyCDT-lung的关键优势在于能够比“CT(标准诊断影像学检查)”更早地帮助鉴定肺癌风险，具有更高特异性[8]。在乳腺癌方面，研究已表明在乳腺癌患者诊断5年前的无症状阶段自身抗体就呈现阳性结果[9]。有国外研究发现，与正常对照者相比，ZRF自身抗体和KRR1自身抗体在早期乳腺癌患者血清中的水平均显著升高[8]。这些研究提示，肿瘤自身抗体在乳腺癌患者血清中是存在的，有潜力作为一种有效的乳腺癌早期诊断方法。

热休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是一组广泛存在于生物体内、高度保守的应激蛋白。作为分子伴侣，在细胞内主要参与蛋白质跨膜转运、装配分选解等过程，并且在创伤、感染和恶性肿瘤等应激状态下被诱导表达[9]。Hsp70作为热休克蛋白家族的一员，已被证实在多种肿瘤中高表达，并在肿瘤的发生发展、预后和肿瘤免疫等发挥重要作用[10-11]。研究表明，针对肿瘤相关抗原的自身抗体的产生和肿瘤相关抗原本身的突变和过表达等密切相关[12]。崔晓梅等[13]的研究表明，Hsp70在乳腺癌组织细胞中高表达。Yang等学者[14]的研究证实了Hsp70自身抗体在乳腺癌患者的水平高于健康对照者，而且联合包括Hsp70自身抗体在内的5种自身抗体组合，对乳腺癌的诊断敏感度和特异度达到了82.7%和100.0%。在本研究中，相对于健康体检者与乳腺良性肿瘤患者，血清Hsp70自身抗体在乳腺癌患者中的水平显著升高，表明Hsp70自身抗体可以区分乳腺癌患者和健康者，更重要的是，Hsp70自身抗体有助于区分乳腺良恶性肿瘤。另一方面，本研究结果表明，Hsp70自身抗体对于乳腺癌具有较好的敏感度(80%以上)，有利于将Hsp70自身抗体作为一种乳腺癌的筛查工具以帮助发现更多无症状乳腺癌患者，然而，其特异度相对较差，诊断鉴定乳腺癌患者仍需借助影像学技术和病理检查。

综上所述，Hsp70自身抗体与乳腺癌患者存在相关性，可以帮助区分乳腺良恶性肿瘤，是筛查乳腺癌一种潜在的血清分子标志物。但本研究的样本量较小，而且未能统计分析纳入本研究的乳腺癌患者临床病理资料，因此，未来仍需要通过大样本的早期乳腺癌患者对Hsp70自身抗体进行诊断效能验证。