槲皮黄酮抑制LRIG2/EGFR 信号转导诱导人皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡

张洋，吕君，陈尚周，雷淑英

（恩施土家族苗族自治州中心医院，湖北 恩施 445000）

过度暴晒、晒伤病史常与恶性皮肤癌的发生率增加有关，皮肤癌在白种人群中是较为常见的恶性肿瘤，每年全世界新增300 万的非黑色素瘤皮肤癌患者[1]。非黑色素瘤皮肤癌发病率的增加，迫切需求开发新的治疗方法、预防措施，以及优化诊断。非黑色素瘤皮肤癌起源于角质形成细胞，根据肿瘤发生的细胞类型可分为基底细胞癌和皮肤鳞状细胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）[2-3]。已有研究指出，生长因子及其受体表达失调对肿瘤的发生和发展有着重要影响[4]，其中表皮生长因子受体（EGFR）在CSCC 中起着关键作用[5]。EGFR 在人表皮中广泛表达，调节表皮内环境稳定、细胞增殖、分化和细胞死亡等过程[6]。

富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域2（LRIG2）属于一种跨膜蛋白，在整个表皮中均有表达，参与受体酪氨酸激酶的调节，如EGFR 受体[7]。LRIG2 可促进EGFR 信号转导作为胶质母细胞瘤细胞的正反馈回路，提示LRIG2 是一种促癌基因[8]。近期研究表明，LRIG2 可通过激活EGFR 信号通路增加CSCC 的癌变过程[9]。

Qu 是黄酮类化合物，主要分布在蕨类植物、裸子植物及被子植物中，有较强的抗肿瘤活性[10]。已有研究证实Qu 对辐射诱导的皮肤纤维化有保护作用[11]。然而，Qu 对CSCC 细胞的增殖是否有抑制作用，尚未见报道。因此，本实验观察Qu 对A431 细胞增殖、凋亡及LRIG2/EGFR 信号转导的影响。

1 材料及方法

1.1 一般资料

1.1.1 材料及试剂 A431 细胞株来源于上海ATCC 细胞库；DMEM 培养液、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco 公司；CCK8 试剂盒购自Solarbio 公司，批号40203ES60；RIPA 裂解液购自杭州四季青公司，批号SB203580；BCA 蛋白定量试剂盒购自北京康为世纪，批号H20000337；Annexin V/FITC 细胞凋亡试剂盒购自北京四正柏生物公司，批号KGA107；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-3/9 活性检测试剂盒购自Solarbio 公司，批号C10268951；兔抗鼠Bax（批号ab1098963）、B 淋巴细胞瘤-2 基因（Bcl-2，批号ab0983652）、LRIG2（批号ab02764633）、EGFR（批号ab2019874）、p-EGFR（批号ab0023876）及β-actin（批号ab1829095）抗体购自英国Abcam公司；羊抗兔IgG 二抗（上海谷歌生物公司）；ELC化学发光检测试剂盒（Advansta）。

1.1.2 主要仪器 BIORAD-550 型酶标仪（美国伯乐公司）；BBS-V800 型单人超净台（山东鑫贝西公司）；SPX-250 型细胞培养箱（美国Thermo 公司）；GE-100 型凝胶电泳仪（北京六一仪器厂）；Amersham Imager 600 仪器（BIO-RAD，美国）；FACSCalibur 型流式细胞仪（美国Becton Dickinson 公司）。

1.2 方法

1.2.1 A431 细胞培养 采用含10%胎牛血清和1%抗生素的的DMEM 培养基对A431 细胞进行培养，培养箱条件设置为5%二氧化碳（CO2）、37 ℃恒温。待细胞融合至90%左右时，便进行传代培养。首先磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞2 遍，加入胰蛋白酶进行消化细胞，待细胞变圆后加入培养基终止消化，转移至EP 离心管，1 000 r/min（离心半径20 cm）离心5 min，弃去旧培养液，加入新鲜培养液重悬细胞进行后续实验。

1.2.2 CCK8 实验 将对数期A431 细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞，培养过夜，然后加入10～200 μg/mL 的Qu 处理细胞12、24、48、72 h 后，弃去旧培养液，每孔加入100 μL 含10 μL 的CCK8 试剂的DMEM 培养液，放入培养箱中继续孵育1.5 h，在酶标仪450 nm 波长处检测细胞吸光度OD 值，并计算细胞相对活力。计算公式如下：细胞相对活力（%）=OD实验组/OD对照组×100%。

1.2.3 细胞克隆数分析 将对数期A431 细胞接种于6 孔板，每孔1 000 个细胞，培养过夜，然后加入10～200 μg/mL 的Qu 处理细胞6 d 后，每2 d 更换1次含药的新鲜培养液；然后对克隆细胞进行染色并计数。

1.2.4 5-溴-2-脱氧脲苷试剂（BrdU）ELISA 实验 将对数期A431 细胞接种于96 孔板，每孔1×104个细胞，培养过夜；10～200 μg/mL 的Qu 处理细胞48 h 后，加入BrdU 试剂孵育12 h；再采用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测BrdU 偶联的细胞，并在酶标仪405 nm 处测定其吸光度OD 值。

1.2.5 流式细胞术 收集各组细胞，PBS 清洗2 次，采用2.0 mg/mL 的PI 染液和RNaseⅠ染色30 min，流式细胞仪立即检测细胞周期分布情况。另外，收集细胞，PBS 重悬后，分别加入Annexin-V FITC 和PI 处理细胞（按照试剂盒操作说明书进行），最后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.6 Western blot 实验 收集各组细胞，每组加入200 μL 的裂解液，置于冰上充分裂解30 min，收集细胞裂解液，4 ℃条件下12 000 r/min（离心半径为20 cm）离心12 min，收集上清。BCA 法检测了上清中总蛋白浓度，每孔上样40 μg 进行电泳分离，恒压70 V，电泳3 h。然后在恒流275 mA 条件下电转70 min，5%脱脂牛奶封闭1 h 后，将目的条带放入对应的一抗溶液（稀释比1∶1 000）中，4 ℃摇床孵育过夜。洗膜缓冲液（TBST）洗膜3 次，10 min/次，再把条带放入盛二抗（稀释比1∶3 000）的平皿中室温孵育1 h，TBST 洗膜3 次，10 min/次。加入4 mL 的ECL 显影液显色3 min，凝胶成像系统曝光。

1.2.7 Caspase-3/9 活性试验 收集各组细胞，采用Caspase-glot-3/9 活性测定试剂盒检测Caspase-3/9活性，酶标仪在405 nm 处测定其吸光度值。

1.2.8 LRIG2 质粒转染 LRIG2 mimics 和LRIG2 inhibitor 质粒由武汉巴菲尔生物有限公司合成，序列分别为：5’-CTGGACAGTGTGTTTGA-3’，5’-CCUCAGAGUUCACGGACAU-3’。采用Lipofectamine 2 000 试剂转染质粒至A431 细胞，具体操作步骤严格按照说明书进行。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0 统计软件进行统计分析，两两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Qu 对A431 细胞增殖活性的影响 Qu 对A431 细胞活力影响见图1a，发现浓度高于50 μg/mL的Qu 处理细胞48 h 和72 h 时，细胞活力相比于0 μg/mL 的Qu 组明显降低（P＜0.05）。Qu 对A431 细胞克隆的影响见图1b，提示浓度＞50 μg/mL 的Qu处理细胞48 h 时，细胞克隆数相比于0 μg/mL 的Qu 组明显降低（P＜0.05）。Qu 对BrdU 偶联细胞数的影响见图1c，提示浓度高于50 μg/mL 的Qu 处理细胞48 h 时，BrdU 偶联细胞数相比于0 μg/mL 的Qu组明显降低（P＜0.05）。另外，流式细胞术检测A431细胞周期分布如图1 d，100 μg/mL 的Qu 处理细胞48 h，G1期细胞数明显增高，而S 和G2期细胞数明显减少（P＜0.05）。

图1 Qu 对A431 细胞增殖的影响

2.2 Qu 多A431 细胞凋亡的影响 Qu 对A431 细胞中凋亡相关蛋白影响见图2a、b，发现Qu 能明显诱导促凋亡蛋白Bax 表达，而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达（P＜0.05）。Qu 对凋亡蛋白Caspase-3/9 活性影响见图2c，提示Qu 能明显诱导Caspase-3/9 活性增高（P＜0.05）。另外，流式细胞术检测A431 细胞凋亡率见图2d，浓度高于50 μg/mL 的Qu 处理细胞48 h时，细胞凋亡率相比于0 μg/mL 的Qu 组明显升高（P＜0.05）。

图2 Qu 对A431 细胞凋亡的影响

2.3 Qu 对A431 细胞中LRIG2/EGFR 信号通路的影响 100 μg/mL 的Qu 处理细胞48 h 时，相比于0 μg/mL 的Qu 组LRIG2 和p-EGFR 表达水平明显降低（P＜0.05）；然而，EGFR 表达水平没有发生明显变化（P＞0.05），见图3。

图3 Qu 对LRIG2/EGFR 信号转导的影响

2.4 EGFR 激动剂NSC228155 对A431 细胞生长的影响 Qu 与NSC 228155 共同处理A431 细胞48 h，对细胞活力和凋亡率检测结果见图4。提示Qu+NSC 228155 组细胞活力相比于Qu 组显著增高，而细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）。

图4 NSC 228155 对A431 细胞生长的影响

2.5 Qu 通过LRIG2 诱导A431 细胞凋亡 LRIG2 mimics 和LRIG2 inhibitor 质粒转染A431 细胞，可分别上调和沉默LRIG2 基因表达，见图5a、b。相比于Qu 组，Qu+LRIG2 mimics 组p-EGFR 表达水平明显升高，细胞活力明显升高，细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）；Qu+LRIG2 inhibitor 组p-EGFR 表达水平明显降低，细胞活力明显降低，细胞凋亡率显著增高（P＜0.05）。相比于对照组，Qu+LRIG2 mimics 组p-EGFR 表达水平明显降低，细胞活力明显降低，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；Qu+LRIG2 inhibitor 组p-EGFR 表达水平明显降低，细胞活力明显降低，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），见图5c～f。3 讨论

图5 Qu 通过LRIG2 调节A431 细胞生长

Qu 有抗肿瘤的药理活性，表现出抑制癌细胞生长、诱导其凋亡的生物学效应。然而，相关作用机制尚不清楚。Qu 有多种抗癌特性，包括调节细胞信号传导、促凋亡、抗增殖、抗氧化及抑制生长等。事实上，现在学者们已经知道Qu 有多种生物学效应，抑制多种酶参与细胞增殖以及信号转导通路。另一方面，也有研究报告，当Qu 联合化疗药物或放射治疗对多种癌症都表现出潜在的协同效应，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌及肝癌等[12]。于是，该实验主要目的是阐述Qu 对体外培养的A431 细胞凋亡的诱导机制。实验结果提示，Qu 可抑制A431 细胞增殖，促使其凋亡；降低LRIG2 表达，抑制EGFR 磷酸化；Qu通过介导LRIG2/EGFR 信号转导诱导A431 细胞凋亡。肿瘤发生机制研究已证实细胞凋亡是药物化疗或放疗的结果，由信号网络基因的表达异常参与此过程。细胞凋亡途径包括死亡受体途径及线粒体途径，均能进一步活化Caspase-3，引发内切核酸酶活化，导致细胞凋亡发生[12-13]。Caspase 是调控细胞凋亡的主要蛋白，主要通过抑制Caspase-3 和Caspase-9活性阻断细胞的凋亡，并且这些蛋白的表达水平与CSCC 的增殖、凋亡相关密切[14-15]。本研究揭示Qu 能明显增强Caspase-3/9 活性、增高促凋亡蛋白Bax表达及抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 表达，进而诱导A431细胞凋亡。

本课题进一步探讨了Qu 诱导A431 细胞凋亡的分子机制。LRIG2 蛋白是不同受体酪氨酸激酶的重要调节因子，参与EGFR 受体家族的正负反馈循环[16]。LRIG2 是一种促癌蛋白，其表达水平增高与宫颈鳞状细胞癌、非小细胞肺癌和胶质母细胞瘤的预后不良有关[17-19]。另外，LRIG2 在CSCC 细胞中表达水平明显上调，与促使了皮肤的癌变过程[9]。与上述研究结果类似，本实验发现Qu 降低LRIG2 表达水平，进而诱导A431 细胞凋亡。

EGFR 表达失调对肿瘤的发生和发展有着重要影响，包括CSCC[5]。EGFR 在人表皮中广泛表达，调节表皮内环境稳定、细胞增殖、分化和细胞死亡等过程[6]。本实验发现Qu 可抑制EGFR 磷酸化水平，进而降低A431 细胞增殖活性。采用EGFR 激动剂与Qu 共处理A431 细胞时，发现其可部分逆转Qu对A431 细胞的毒性作用，说明Qu 通过EGFR 信号通路发挥抗CSCC 的作用。实验进一步观察LRIG2关键蛋白的枢纽作用，对LRIG2 基因进行过表达和沉默，发现LRIG2 基因过表达会部分逆转Qu 对EGFR 磷酸化的抑制作用及A431 细胞的毒性作用，提示Qu 是通过LRIG2/EGFR 信号通路发挥抗CSCC 的药理活性。

综上所述，Qu 可通过诱导A431 细胞凋亡和抑制细胞增殖发挥抗肿瘤作用，其机制可能与抑制LRIG2/EGFR 信号通路活化有关。