响应面法优化氧化槐定碱脂质体的制备及表征

郭留城，杜利月，冯慧慧，高笑笑，崔凤灵

(河南师范大学 化学化工学院，河南 新乡 453007)

氧化槐定碱(Oxysophoridine，OSR)是从豆科槐属植物苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)中提取得到的一种重要的生物碱，现已经可以人工合成.现代药理学研究证明，OSR具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等多种药理活性[1-4].然而，由于其半衰期短，体内没有靶向性，会导致人体产生呼吸减慢、昏迷、甚至死亡等不良反应[4].

在贮存的过程中，氧化槐定碱易变质.张军帅等人[5]采用冷冻干燥法将OSR制备成了粉针剂，延缓了制剂中OSR的变质，延长了OSR制剂的保质期，提高了OSR制剂的用药安全.然而将OSR制备成靶向制剂的研究，尚未见有报道.从提高临床疗效、降低副作用的角度入手，利用单因素实验和Box-Behnken响应面设计等实验技术，将OSR制备成具有靶向功能的脂质体制剂，可以在一定程度上提高OSR的疗效，降低毒副作用，方便临床用药，也可以丰富OSR的药物制剂，从而使OSR更好地服务于临床[6].薄膜法制备的脂质体分散性好，载药量较高[6-7]，因此，本文采用改良薄膜法制备OSR脂质体.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

主要试剂:氧化槐定碱对照品(批号：190322，纯度98.7%)和氧化槐定碱原料(批号：190409)购于南京道斯夫生物科技有限公司，大豆卵磷脂(批号：EXR1DRK4)和胆固醇(批号：R8ARE2KU)购于上海萨恩化学技术有限公司，乙腈(色谱级，批号：C11988756)购于上海麦克林生化科技有限公司，蒸馏水自制，其他试剂均为分析纯.

主要仪器：JEM-2100型高分辨透射电子显微镜(日本电子公司)、Zetasizer Nano ZS 90(马尔文)激光粒度仪(德芮克国际股份有限公司)、1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)、Agilent Cary100型紫外-可见分光光度计(美国安捷伦科技公司)、RE100-S型旋转蒸发仪(北京大龙兴创实验仪器股份公司)、DSC204F1型差示扫描量热仪(德国耐驰公司)、Spectrum 400F型中远红外光谱仪(美国珀金埃尔默仪器有限公司)、MS105DU/A型分析天平(梅特勒-托利多国际有限公司).

1.2 溶液的配制及OSR脂质体的制备

OSR储备液的制备：精密称取OSR对照品13.2 mg，用双蒸水配制成1 mmol/L的溶液.

PBS缓冲溶液的配制：称取4.00 g NaCl,0.10 g KCl,0.72 g Na2HPO4,0.12 g KH2PO4溶于400 mL蒸馏水中，用HCl调节pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至500 mL，即得PBS缓冲液[4].

大豆卵磷脂(Lecithin High Potency，LHP)和胆固醇(Cholesterol，CHO)混合液的制备：称取LHP 2.4 g和CHO 0.4 g，加入100 mL氯仿超声溶解后，制成240 mL溶液，作为LHP和CHO的混合液.

OSR脂质体的制备：取处方量的LHP和CHO混合溶液，在室温下，旋干溶剂，加入处方量的OSR(原料)溶液，37 ℃涡旋水合1 h，再加入处方量的PBS缓冲溶液，涡旋水合至规定时间，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得OSR脂质体[6,8-9].

供试品溶液的制备[8]：取OSR脂质体5 mL，离心分离脂质体，精密量取上清液2 mL，用PBS缓冲溶液稀释，使OSR的质量浓度约为120 μg/mL，摇匀，0.22 μm滤膜过滤，即得.

阴性溶液的制备[9]：制备不含OSR的空白脂质体，操作方法同“供试品溶液的制备”，即得.

1.3 OSR含量(质量分数)测定方法

1.3.1色谱条件

采用Waters Symmetry®C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为0.05%(质量分数)的三乙胺水溶液(磷酸调pH为3.5)与乙腈混合液(体积比为95∶5)；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL.

1.3.2专属性实验

按照1.3.1中色谱条件设定仪器参数，进样量10 μL，取1.2中的对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，进样测定，记录色谱图谱[10-11].

1.3.3线性关系的考察

按照1.3.1中色谱条件设定仪器参数，取OSR储备液适量，制成240.840、187.320、133.800、80.280、26.760、24.084、18.732、13.380、8.028、2.676 μg/mL的溶液，分别进样测定，记录色谱图谱和峰面积[5,11]，计算出回归方程.

1.3.4方法学考察

按照文献报道[5,11-12]的方法进行精密度实验、重复性实验和加样回收率实验.

精密度实验：取对照品溶液，进样6次，记录色谱图谱和峰面积.

重复性实验：平行制备OSR脂质体6批，按照1.2中供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，按照1.3.1中色谱条件做重复性实验，记录色谱图谱和峰面积.

加样回收率实验：取1 g LHP和300 mg CHO溶于10 mL氯仿中，在室温下，旋干溶剂.平行制备3批，分别加入OSR 120 mg、150 mg、180 mg，按照1.2中OSR脂质体的制备方法，制备3种不同质量浓度的OSR脂质体.按1.3.1中色谱条件，测定脂质体中OSR的质量分数，计算平均回收率.

1.4 包封率和载药量的测定

取制备好的OSR脂质体5 mL，在转速为50 000 r/min条件下，离心30 min[13]，取上清液用0.22 μm滤膜过滤，按1.3.1中色谱条件，测定OSR的峰面积，计算OSR的质量，作为未包封OSR质量W1；制备脂质体时加入的OSR质量为W2，制备脂质体时加入的辅料质量为W3，分别计算包封率(encapsulation efficiency，EE%)和载药量(drug loading capacity，DL%)[6,8-9]：

1.5 单因素实验方法

改变LHP和CHO的质量比:固定LHP的用量为1 g,OSR的用量为150 mg，改变CHO的用量，使LHP和CHO的质量比为10∶0.5,10∶1.0,10∶3.0,10∶5.0,10∶7.0,10∶9.0和10∶10.0.按上述质量比，称取LHP和CHO，加入氯仿溶解后，按照1.2中操作，制备OSR脂质体.按1.2中供试品溶液的制备方法，将OSR脂质体制备成供试品溶液，按照1.3.1中色谱条件，采用HPLC法测定未包封的OSR，计算包封率[8-9].

改变LHP和OSR的质量比:固定LHP的用量为1 g，CHO的用量为300 mg，改变OSR的用量，使LHP和OSR的质量比为10∶0.5,10∶1.0,10∶1.5,10∶2.0,10∶3.0,10∶5.0和10∶7.0.按照1.2中操作，制备OSR脂质体.按1.2中供试品溶液的制备方法，将OSR脂质体制备成供试品溶液，按照1.3.1中色谱条件，采用HPLC法测定未包封的OSR，计算包封率[8-9].

水合时间的优化:量取LHP和CHO的混合液2 mL和1 mmol/L OSR缓冲溶液1 mL，分别采用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h的水合时间制备OSR脂质体，按照1.2中操作，制备OSR脂质体.按1.2中供试品溶液的制备方法，将OSR脂质体制备成供试品溶液，按照1.3.1中色谱条件，采用HPLC法测定未包封的OSR，计算包封率[6,8-9].

1.6 响应面优化实验

单因素实验无法评估实验过程中不同因素之间的相互作用，因此，采用Design-Expert.V8.0.6.1 软件进行响应面设计，优化OSR脂质体的制备过程，以揭示这些不同单因素之间的相互作用，并优化OSR脂质体的制备过程[8-9,14-15].选择对包封率有显著影响的3个参数(LHP与CHO的质量比：A；LHP与OSR的质量比：B；水合时间：C，h)作为考察对象，以包封率作为测定指标.结合1.5中实验结果，每个因素选择3个级别.这3个因素的3个级别(-1、0、1)分别如下：LHP与CHO的质量比(10∶1.0,10∶3.0,10∶5.0)，LHP与OSR的质量比(10∶1.0,10∶1.5和10∶2.0)和水合时间(1.0、1.5和2.0 h).构建了包含17个实验运行的设计矩阵，进行响应面优化实验.

1.7 验证实验

采用响应面实验优化后的最佳制备工艺，制备3批OSR脂质体，按1.2中供试品溶液的制备方法，分别将OSR脂质体制备成供试品溶液，按照1.3.1中色谱条件，采用HPLC法测定未包封的OSR，计算包封率.

1.8 OSR脂质体的表征

载药量的测定:取1.7中制备的OSR脂质体混悬液，按1.2中供试品溶液的制备方法，分别将OSR脂质体制备成供试品溶液，按照1.3.1中色谱条件，采用HPLC法测定未包封的OSR，按1.4中载药量计算公式，计算载药量.

脂质体形态:取1.7中制备的OSR脂质体混悬液，以超纯水适当稀释后，在专用铜网上制样，在防尘装置中静置并自然挥干，使OSR样品沉积在铜网上，放大5万倍，加速电压200 kV，观察并摄像[8-9].

粒径分布与Zeta电位:取1.7中制备的OSR脂质体混悬液，以超纯水适当稀释后，采用动态光散射仪测定Zeta电位、粒径及粒径分布[8,14].

红外光谱表征:取1.7中制备的OSR脂质体混悬液，真空干燥得OSR脂质体粉末.分别取CHO,LHP,OSR,物理混合物和OSR脂质体粉末，加入溴化钾固体，充分研细，压片，在400～4 000 cm-1范围内进行红外分光扫描，记录图谱[8].

差示扫描量热分析:取CHO,LHP,OSR,物理混合物与1.7中制备的OSR悬混液真空干燥后的脂质体粉末，进行差示扫描量热(differential scanning calorimetry，DSC)分析.工作条件：以空铝坩埚为空白参考池，另一铝坩埚为样品池，在样品池中放入样品约10 mg，置于机器中进行图谱扫描；N2作为吹扫气，扫描速度10 ℃·min-1，扫描范围30～300 ℃，记录图谱[8].

2 实验结果与讨论

2.1 测定方法的可靠性

2.1.1专属性实验结果

OSR含量测定方法的专属性实验结果见图1.结果显示OSR的分离度较好，专属性强，阴性无干扰.

2.1.2线性关系考察结果

测得的OSR峰面积，用Origin Pro 8.5软件进行线性回归分析，得回归方程为Y=5.487 27X-1.535 23，相关系数R2=0.999 5，线性范围为：2.676～240.840 μg/mL.结果显示OSR的质量分数与峰面积呈良好的线性关系.

2.1.3方法学考察结果

精密度实验测得的OSR峰面积，用Origin Pro 8.5软件进行线性回归分析，峰面积的RSD值为0.58%(n=6).重复性实验测得的OSR峰面积，用Excel 2016软件进行相对标准偏差(RSD值)分析，峰面积的RSD值为0.91%(n=6).回收率实验测得的OSR峰面积，用Excel 2016软件进行均值和相对标准偏差(RSD值)分析，3种不同质量浓度的OSR溶液，平均回收率分别为98.53%，99.22%，98.79%，RSD值分别为0.83%，0.93%，0.86%(n=3).结果表明，精密度、重复性和回收率均符合《中华人民共和国药典》2020年版四部通则9101项下规定.

2.2 单因素实验结果

LHP与CHO不同质量比的单因素实验结果见图2.由图2可知，随着CHO质量的增加包封率先升高，随后下降，在LHP和CHO的质量比为10∶3.0时包封率达到最佳.LHP与OSR不同质量比的单因素实验结果见图3.由图3可知，随着OSR质量的增加包封率先升高，随后下降，在质量比为10∶1.5时包封率达到最佳.

不同水合时间对OSR脂质体影响的单因素实验结果见图4.由图4可知，随着水合时间的增加包封率逐渐升高，在水合时间大于1.5 h时包封率基本不再增加.因此，选择LHP与CHO的质量比为10∶1.0,10∶3.0,10∶5.0，LHP与OSR的质量比为10∶1.0,10∶1.5和10∶2.0和水合时间为1.0、1.5和2.0 h，作为响应面优化实验的因素水平.

2.3 响应面优化实验结果

应用Design-Expert V8.0.6.1对实验数据进行分析，响应面优化实验设计与结果见表1，响应面模型的方差分析结果见表2，3个因素对包封率的等高线和三维响应面见图5、图6和图7.以包封率对各因素自变量进行模型拟合，通过拟合得到的二次回归方程为OSR包封率(%)=59.27+0.79A+1.89B-1.15C-0.62AB-3.96AC-1.72BC-11.58A2-12.48B2-9.66C2(R2=0.938 6，失拟度检验F值为5.65，P=0.063 8>0.05)，由拟合方程结果可知拟合模型F值为11.90(P=0.001 8<0.05)，信噪比值为8.425，相对较高，表明该拟合模型拟合结果良好，实测值与预测值之间的相关性较高，能够高度准确地预测实验结果的实际情况.

表1 Box-Behnken实验设计与结果

表2 Box-Behnken响应面模型的方差分析

根据二次回归方程拟合结果，固定一个因素水平[14-15]，进行OSR包封率对其他两个因素的拟合，得到实验结果的三维效应曲面图，并对OSR的提取工艺参数进行优选.图5、图6和图7中OSR的包封率随着各变量的增加而增加，到达最大值后逐渐下降.最佳制备工艺处方为：LHP与CHO的质量比为10∶3.09、LHP与OSR的质量比为10∶1.54、水合时间为1.46 h，与单因素实验结果基本吻合.

2.4 工艺验证实验结果

按最优工艺制备的3批OSR脂质体的包封率分别为57.68%，57.30%，59.09%，平均包封率为58.02%，RSD值为1.63%.OSR脂质体包封率的实测平均值为58.02%与预测值为59.41%非常接近，偏差较小，预测性良好，说明OSR的最佳制备工艺稳定、可行.

2.5 OSR脂质体的表征

2.5.1载药量的测定

按最优工艺制备的3批OSR脂质体的载药量分别为6.24%，6.20%，6.38%，平均载药量为6.27%，RSD值为1.52%，平行3批OSR脂质体的载药量误差较小，说明OSR的最佳制备工艺稳定.

2.5.2脂质体形态

透射电镜拍摄的OSR脂质体的形状，见图8.由图8可知，OSR的外观成类球形均匀分散，多数为单室脂质体.

2.5.3粒径分布与Zeta电位测定结果

动态光散射仪测定的粒径及粒径分布结果见图9，Zeta电位测定结果见图10.由图9可知，OSR的粒径为154.1 nm，分散系数(PDI)为0.329，说明OSR脂质体粒径分布较为均匀；由图10可知，OSR脂质体的Zeta电位为-29.9 mV，其绝对值≫15 mV，结合DLVO理论可知，制备的OSR脂质体混悬液稳定，不易发生絮凝[8,15].

2.5.4红外光谱表征结果

OSR脂质体的红外测定结果见图11.图11 a线显示，1 670 cm-1处吸收峰为CHO的C=C伸缩振动峰，3 431 cm-1处的吸收峰为CHO的-OH伸缩振动峰，2 934 cm-1为-CH3的伸缩振动峰，1 360～1 470 cm-1为-CH3的不对称伸缩振动.图11b线显示，1 630 cm-1和3 010 cm-1处吸收峰分别为LHP的C=C伸缩振动峰和碳碳双键上氢的伸缩振动峰，1 740 cm-1和1 236 cm-1处吸收峰分别为LHP分子中酯键的C=O和C-O-C伸缩振动峰，3 323 cm-1处的吸收峰为LHP的-OH和-NH的伸缩振动峰，2 925 cm-1、2 853 cm-1和1 466 cm-1依次为-CH2-的不对称伸缩振动、对称伸缩振动和面内弯曲振动峰，1 090 cm-1和722 cm-1分别为醇羟基的C-O伸缩振动峰和O-H面外弯曲振动峰；1 066 cm-1、1 657 cm-1和827 cm-1分别为氨基的C-N伸缩振动峰、N-H面内弯曲振动峰和N-H面外弯曲振动峰，1 378 cm-1为-CH3的面内对称弯曲振动峰，-CH3的面内不对称弯曲振动峰和伸缩振动峰被-CH2-相应位置的峰所掩盖.图11c线是CHO和LHP物理混合物的红外图谱，对比图11a,b,c 3线可知，图11c线是图11a线和b线简单地叠加，明显区别于OSR脂质体的红外图11e线.图11d线显示，1 620 cm-1和1 249 cm-1处吸收峰分别为OSR分子中酰胺键的C=O和C-N伸缩振动峰，1 020 cm-1～1 220 cm-1处吸收峰为OSR分子中的叔胺中C-N伸缩振动峰，1 349 cm-1和1 304 cm-1处吸收峰为OSR分子中叔碳氢的振动吸收峰，其余的吸收峰为OSR的不同化学环境中-CH2-的振动峰.图11e线显示，OSR分子中酰胺键的C=O和C-N伸缩振动峰、叔胺中C-N伸缩振动峰和叔碳氢的振动吸收峰得以保留，红外吸收峰位几乎没有变化，说明OSR进入脂质体囊泡中.此外，图11e线与c线和d线对比，在2 000～3 600 cm-1范围内OSR脂质体的红外吸收峰的位置和峰形发生了明显的变化，进一步说明OSR进入脂质体囊泡中.

2.5.5差示扫描量热分析结果

OSR脂质体的差示扫描量热分析测定结果见图12.图12结果表明，CHO(a线)在151.1 ℃时出现一个熔点峰；LHP是由卵磷脂、脑磷脂、肌醇磷脂、神经鞘磷脂、磷脂酸和其他磷脂组成的复杂混合物，所以LHP的DSC图(b线)出现多个吸热峰；OSR(c线)在96.5 ℃时出现一个熔点峰，在225.5 ℃时出现一个放热峰；对比CHO,LHP和OSR的DSC图可以发现，药物与两者的物理混合物的DSC图(d线)是三者的简单叠加，说明药物与CHO和LHP的物理混合物不能形成脂质体；OSR脂质体(e线)在204.8 ℃附近出现新的放热峰，在228.2 ℃附近出现新的吸热峰，说明形成新物质，不是简单的物料叠加，证明生成了OSR脂质体[8].

3 结 论

采用单因素实验法，剖析OSR脂质体制备过程中辅料用量的影响，采用Box-Behnken响应面设计实验，剖析多个因素对OSR脂质体的共同的影响，优化了OSR脂质体的制备工艺.单因素实验与响应面实验设计相结合，具有预测性好的优点，优于只能分析离散型数据的正交实验设计.单因素实验结合Box-Behnken响应面实验，采用线性模型，求得回归方程，通过合理预测得出最佳工艺条件.OSR的最佳制备工艺为：大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为10∶3.09、大豆卵磷脂与药物的质量比为10∶1.54、水合时间为1.46 h.制备的OSR脂质体的外观成类球形，平均粒径为154.1 nm，分散系数为0.329，平均包封率为58.02%(RSD为1.63%)，平均载药量为6.27%(RSD为1.52%)，Zeta电位为-29.9 mV，采用红外光谱法、差示扫描量热分析等表征法证明了OSR脂质体的形成.采用预测的最佳工艺制备的OSR脂质体，粒径较小，PDI值较低，脂质体分散性好，Zeta电位绝对值较高，不易发生沉淀，说明优化的OSR脂质体制备方法稳定可靠.