Trap抗原诱导细胞免疫对S.aureus免疫保护作用的研究

2022-03-04韩先乐张喆林申雪王蓝悦王森刘骓马鑫月崔玉东宋博翠佟春玉

黑龙江八一农垦大学学报 2022年1期

韩先乐，张喆林，申雪，王蓝悦，王森，刘骓，马鑫月，崔玉东，宋博翠，佟春玉

（黑龙江八一农垦大学，大庆 163319）

奶牛乳房炎不但能引起畜产品污染，同时还威胁人类的健康[1]，目前已经成为养殖业中主要且常见的疾病之一。奶牛乳房炎是以金黄色葡萄球菌（S.aureus）为主要致病菌，多种病原菌共同参与所形成的。S.aureus是一种条件致病菌，为革兰氏阳性菌[2]。在奶牛乳房炎感染中所占比例最高，可达40%左右[3]。S.aureus不仅可以造成奶牛乳房炎，同时还能导致多种疾病，它不仅能够引起牛羊等的急性或者慢性乳房炎、鸡鸭等的化脓性的关节炎[4]，猪马等动物的流产、皮炎、创伤感染等[5]，还能引起人的软组织感染、发热和脓肿等病症[6]，甚至危及生命的心内膜炎、肺炎、败血症等[7]，严重威胁着人类的健康。在日常生活中，人们最为常用的抵御S.aureus的手段为抗生素治疗，但是随着人们对抗生素的滥用，导致S.aureus对抗生素的抗药性逐年增加[8-10]。在牧场中，牧民通常采用加大抗生素用量来达到灭菌的作用，其副作用就是加速了S.aureus的抗药性，同时其相关产品，如牛奶等存在大量抗生素残留，这将导致其相关产品的质量迅速下滑[11]。因此，有效的S.aureus疫苗成为防治其感染的理性手段。

在之前的研究报道中，由于人们认为S.aureus只在细胞外寄生，所以人们认为对于S.aureus的保护机制只由体液免疫所介导，S.aureus为条件性致病菌，当S.aureus侵入机体时，被机体内的抗原提呈细胞所捕获之后，通过MHCⅡ类分子提呈至辅助型T细胞，从而启动免疫应答。近年科学家们发现，S.aureus不仅能胞外寄生，同时也会在细胞内寄生，这就提示我们，当S.aureus侵入机体后，在机体启动B细胞介导的免疫应答来抵抗病原的入侵的同时，也会引起相应的T细胞介导的免疫应答。

S.aureus的致病能力是来自于它本身所编码的毒力因子[12]。S.aureus产生毒力因子并将其分泌到体外，这些毒力因子的表达与分泌在整个致病过程中是受到密切调控的[13]。Trap蛋白参与着S.aureus菌体内的庞大且复杂的调控机制，且在其中发挥着重要作用[14]。Trap（Target of RNAIII Activating Protein）在S.aureus中具有高度的保守性，其具有167个氨基酸残基。RNAIII激活蛋白（rap）能够激活Trap蛋白，同时能够激活群体感应系统，从而引起机体表达毒素和致病[15]，Trap在S.aureus应激反应中所发挥的作用最近被证实，可自然突变和适应性突变，保护DNA免受氧化损伤[16]。

根据实验室对Trap蛋白的研究，结合目前已经发表的与Trap蛋白作为免疫原所得到的实验数据来看，Trap蛋白确实具有非常好的免疫原性，另外，实验室对保存的金葡菌菌株进行菌种鉴定以及其他研究学者对金葡菌的测序结果都包含了完整的Trap蛋白基因，这同样说明了Trap蛋白对细菌具有非常重要的作用[17]。Trap所发挥的免疫保护作用，主要是体现在了体液免疫上，但是在细胞免疫方面是否也能发挥作用尚未可知，实验在前人研究的基础上进一步探究Trap蛋白所引起的细胞免疫应答情况，为进一步使Trap得到临床应用提供科研依据。

1 材料和方法

1.1 质粒及菌株

pET-32a/Trap质粒由Sangon Biotech（Shanghai）合成；pET-32a质粒、E.coliBL21（DE3）菌株为南京金斯瑞公司所提供；S.aureusNewman菌株为八一农大细胞生物学室所保存。

1.2 主要试剂

主要试剂：限制性核酸内切酶BamHI、XhoI为New England Biolabs（Beijing）LTD公司产品；TEMED，SDS，考马斯亮蓝R-250，Tween-20等生化试剂均购自康为世纪；Goat anti-mouse IgG-HRP、弗氏佐剂（CFA，IFA）为Sigma-Aldrich公司产品；各种细胞因子的检测试剂盒为达科为公司的优达产品；免疫球蛋白各个亚类是SouthernBiotech公司产品。

1.3 方法

1.3.1 质粒DNA的设计与合成

依据在GeneBank中的S.aureus的Trap基因序列（Gene ID：300430028），加上载体pET-32a的BamHI、XhoI酶切位点，送至上海生工进行合成，并用DNAman与Primer Premier 5软件设计引物，同样交至上海生工合成，引物设计如下：

表1 实验中所使用的引物Table 1 Primers used in the experiment

1.3.2 质粒的提取，酶切及鉴定

划线活化含有Trap/pET-32a质粒的Top10菌液，提取质粒转化至BL21菌内，液体培养，按照质粒提取试剂盒说明，提取上述质粒，对质粒进行定量后取1μg质粒DNA于离心管中，加入1μLBamHⅠ酶，1μLXhoⅠ酶，5μL Cutsmart Buffer，补ddH2O至20μL；37℃温浴60 min，电泳检测。另取1μg上述质粒DNA于离心管中，加入Sense，Antisense各2μL，PCRMix 10μL，补加ddH2O至20μL进行PCR反应，反应的条件为94℃反应10 min；94℃反应30 s，55℃反应30 s，72℃反应60 s，上述过程进行30个循环；72℃反应10 min后4℃储存或进行下一步实验。

1.3.3 Trap蛋白的表达，鉴定及纯化

通过前期的表达条件优化，确定以下实验步骤：取鉴定正确的阳性菌按照1∶100的比例接种于含有Ampicillin的液体LB培养基中，在37℃下180 r·min-1震荡培养至OD600约为0.6，加入IPTG诱导剂至终浓度为1 mmol·L-1，诱导表达4 h后使用破菌裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎菌体，将菌液超声至清澈，4℃、10 000 g离心30 min分别收集上清，分别将上清与沉淀上样跑凝胶以确定其可溶性情况，之后利用纯化柱对两种蛋白进行纯化，-80℃冻存备用。

1.3.4 小鼠的免疫

实验用小鼠是BALB/c小鼠，平均体重为18～20 g左右，雌性，随机地将其分为两组。分别将纯化并稀释后的Trap蛋白、pET-32a标签蛋白与CFA按照1∶1比例进行完全混匀后乳化，通过后腿部肌肉注射的方式对小鼠进行初次接种，接种剂量为每只小鼠10μg，在初次接种后21 d，用同样的两种蛋白与IFA按照1∶1比例进行完全混匀后乳化，按照同样的接种方法对小鼠进行加强免疫。

1.3.5 脾淋巴细胞增殖检测

加强免疫1周后，取小鼠的脾脏，加入红细胞裂解液裂解红细胞后，将得到的小鼠脾淋巴细胞加入到细胞培养板中，每孔100μL细胞，分别用Trap蛋白刺激，每孔2μg，轻轻振荡混匀，同时以无菌PBS缓冲液刺激作为阴性对照，以不加任何细胞和刺激物的培养基作为空白对照。培养2 d后，在孔中CCK-8检测液，每孔10μL，混匀后继续培养3 h，之后检测吸光度。

1.3.6 细胞因子水平检测

将得到的脾淋巴细胞加入到6孔细胞培养板中，每孔2 mL细胞，Trap蛋白刺激，每孔40μg，轻轻振荡混匀，同时以无菌PBS刺激作为阴性对照。培养2 d后，吸取细胞上清，离心后弃沉淀。按照优达说明书，对各细胞因子进行逐个检测。

1.3.7 间接ELISA法检测血清IgG

加强免疫后2周，取各组小鼠各3只，摘除眼球取血，在37℃环境下静置1 h后置于4℃环境中继续静置过夜，之后5 000 g低速离心30 min，吸出上层血清，20μL·管-1分装后冷藏置-80℃保存。将Trap蛋白稀释成5μg·mL-1，每孔100μL包被板子，以小鼠的稀释血清为一抗，兔抗鼠的HRP-IgG（1∶5 000）为二抗，TMB显色液显色，测定吸光度，以样品OD450值≥阴阳性的临界值时样品OD值+3S为阳性临界值的判定，测定抗体滴度。

1.3.8 小鼠攻毒实验

将S.aureusNewman菌活化，在加强免疫后一周，使用不同剂量的Newman菌悬液对同一批次未免疫小鼠腹腔注射进行预攻毒，根据小鼠死亡情况计算小鼠对Newman菌的最大耐受剂量和最小致死剂量。在加强免疫两周后，采用小鼠腹腔注射方式对各组的小鼠注射S.aureusNewman菌株，其攻毒剂量为每只8×108CFU，攻毒2 d后检测小鼠各组织脏器中的细菌定殖情况。对两组小鼠注射S.aureusNewman菌株，其攻毒剂量为每只4×109CFU，攻毒后记录小鼠的存活情况。

1.3.9 免疫小鼠器官中细菌定殖检测

在S.aureusNewman菌攻毒后2 d，各取每组3只，处死后在无菌环境下摘取小鼠的肝、脾、肺、肾后研磨各脏器，将各脏器研磨液10倍比连续稀释2次，每个稀释度吸取20μL涂布于TSA固体培养基平皿，每个样本进行3次，培养16 h，对平皿菌落进行计数，按照研磨液稀释倍数计算各脏器的细菌定殖数。

1.3.10 病理组织切片

将攻毒后一周的小鼠解剖，取肝、脾、肺、肾4个脏器，按照标准试验方法制作为病理组织切片，用苏木精与伊红染色，观察各个脏器的损伤情况。

1.3.11 统计分析

使用Origin2018C分析实验数据，“*”代表P<0.05，“**”代表P<0.01，“***”代表P<0.001。

2 结果与分析

2.1 质粒DNA的合成

对提取的质粒双酶切，结果如图1，分别在5 800 bp处（质粒载体大小）与513 bp处出现条带，说明质粒构建正确。

图1 质粒双酶切结果Fig.1 Results of double enzyme digestion of plasmid

将上述质粒DNA作为模板进行PCR实验，如图2在513 bp处有明亮条带，说明质粒构建成功。

图2 质粒PCR结果Fig.2 Results of plasmid PCR

2.2 Trap蛋白的表达及纯化结果

将含Trap/pET-32a质粒与含pET-32a质粒的菌液扩大培养，使用IPTG对菌体诱导表达，在超声后离心，分别用上清与沉淀进行SDS-Page分析，从图3中我们可以看出，Trap/pET-32a蛋白与pET-32a标签蛋白均为可溶性蛋白。将两个菌液进一步扩大培养，超声破碎后取上清加入至His标签纯化柱内对蛋白进行纯化，纯化结果如图4，在22 kDa处与35 kDa处分别出现单一且清晰的条带，说明蛋白已成功表达。

图3 蛋白可溶性检测Fig.3 Protein solubility test

图4 蛋白纯化结果Fig.4 Protein purification results

2.3 Trap蛋白的表达及纯化结果

经过纯化后的蛋白，分别经过电泳，转模，之后抗体孵育，进行Western blot实验。结果如图5，与Marker相比，纯化后的Trap蛋白分子量在35 kDa左右有条带，蛋白大小与预期的值相符合。

图5 Western Blot结果His标签孵育（左）小鼠血清孵育（右）Fig.5 Western blot results His tag incubation（left）mouse serum incubation（right）

2.4 脾淋巴细胞增殖结果

二次免疫后7 d后，取小鼠的脾脏细胞培养，在蛋白刺激后用CCK-8检测试剂盒检测细胞增殖，结果如图6，两组实验组经Trap蛋白刺激后，显著增殖，但Trap组增殖数量要显著高于pET-32a标签组。

图6 脾淋巴细胞增殖结果Fig.6 Proliferation results of spleen lymphocytes

2.5 疫苗诱导的特异性细胞因子水平

为了探究疫苗所诱导机体，产生细胞免疫应答的水平以及类型，通过间接ELISA方法检测各免疫组小鼠脾淋巴细胞在体外受到Trap蛋白刺激后，细胞所分泌的IFN-γ、IL-10、IL-17A和IL-4四种细胞因子水平。结果如图7，Trap组的各个细胞因子量要明显高于pET-32a标签组，其中，Trap免疫组的IL-4，IL-17A，IL-10的量为pET-32a免疫组的2～3倍，Trap免疫组的IFN-γ的提升更为显著，其为pET-32a免疫组的接近5倍，这说明Trap除了激活体液免疫外更显著地提高细胞免疫来抵抗金黄色葡萄球菌的感染。

图7 细胞因子检测结果Fig.7 Cytokine detection results

2.6 疫苗诱导的血清IgG抗体效价

为了探究疫苗诱导小鼠产生的特异性IgG的抗体效价，在加强免疫两周后，取Trap和pET-32a免疫组小鼠血清，以Trap作为包被抗原，检测IgG抗体水平，免疫组及pET-32a对照组小鼠血清的特异性IgG抗体效价如图8所示，Trap免疫组的抗体滴度达到了1∶64 000-1∶128 000，而pET-32a标签组的抗体滴度只有1∶1 000，说明Trap蛋白能引起强烈的体液免疫应答。

图8 抗体效价检测结果Fig.8 Antibody titer test results

2.7 疫苗诱导的血清IgG亚类水平

为了探究疫苗所诱导的小鼠产生的特异性IgG亚类水平，在加强免疫两周后，取Trap和pET-32a免疫组小鼠血清，以Trap作为包被抗原，检测IgG抗体水平，免疫组及pET-32a对照组小鼠血清的特异性IgG抗体亚类水平如图9所示，抗Trap特异性抗体主要由IgG1和IgG2a与IgG2b所组成，Trap免疫组的IgG1水平要高于pET-32a对照组3.5倍左右，而Trap免疫组的IgG2a水平能达到4倍之多，IgG2a升高倍数要大于IgG1提高倍数，这说明除了激活体液免疫外更显著的激活细胞免疫抗金黄色葡萄球菌感染。

图9 抗体亚类检测结果Fig.9 Antibody subclass detection results

2.8 Trap蛋白对小鼠的免疫保护作用

在二免后2周，用S.aureusNewman株进行攻毒，攻毒的量为每只4×109CFU，攻毒后，在一周内记录死亡状况。结果如图10，经过一周Trap蛋白免疫组小鼠存活率为50%，而标签蛋白免疫组小鼠的存活率仅为10%，因此Trap蛋白免疫组对小鼠的致死保护率约为56%。

图10 S.aureus Newman菌攻毒后小鼠的存亡情况（n=10）Fig.10 Survival of mice challenged with S.aureus Newman（n=10）

2.9 Trap免疫小鼠器官中的细菌定殖量

为了评价Trap疫苗免疫接种诱导的免疫保护作用，加强免疫接种后两周，用S.aureusNewman株对小鼠进行腹腔攻毒，48 h后通过细菌在各个器官内的定殖数，来评价疫苗的免疫保护效果。结果如图11所示，各免疫组小鼠的脾脏、肝脏、肺脏和肾脏均有细菌定殖，且Trap免疫组所有的器官内细菌的量要显著小于pET-32a标签组。

图11 S.aureus Newman株攻毒后在小鼠的脏器中的定殖情况Fig.11 Colonization of S.aureus Newman strain in mice organs after poisoning

2.10 S.aureus攻毒后对各个脏器的损伤情况

S.aureus攻毒后会对各个脏器有所损伤，实验采用病理组织切片，染色后观察形态，对损伤情况做一个判断，结果如图12，pET-32a标签组出现了明显的组织损伤情况，而Trap免疫组各组织几乎没有受到太大损伤，说明Trap免疫组对集体的免疫保护程度要明显高于pET-32a标签组。

图12 免疫小鼠脏器中S.aureus Newman株对组织的损伤情况Fig.12 Damage of S.aureus Newman strain to tissues in organs of immunized mice

3 讨论

奶牛乳房炎的发生不是单一病原所造成的，但是其主要致病菌为S.aureus，而目前农牧场仍在使用的抗生素治疗。但是由于抗生素地滥用导致抗药菌株不断出现以及抗生素污染。因此疫苗成为S.aureus防治的理想手段。传统的研究认为S.aureus只能引起机体的体液免疫应答，但是最近研究结果表明机体内细胞免疫应答在S.aureus感染中同样具有非常重要的作用，IFN-γ细胞因子的升高是Ⅰ类辅助性T细胞反应的标志，在小鼠的败血症模型中，这种炎性的Th1亚类被证明具有保护作用[18]。同时，有研究证明，S.aureus的感染还与缺乏Th17反映有关，如DOCK8、CARD9与HIV等[19-20]。在没有B细胞反应与特异性抗体的情况下，IL-17在防止皮肤炎性反应中的保护作用也得到了证实[21]，对于S.aureus反复感染的患者的调查表明，产生IL-17A的CD4+细胞在S.aureus的自然清除中起着重要作用[22]。

实验将Trap基因进行了密码子优化后克隆入pET-32质粒中构建了Trap/pET-32a表达质粒，通过IPTG诱导表达，成功表达出Trap蛋白，经过His标签蛋白纯化柱纯化蛋白，与弗式佐剂混合后制备疫苗，通过肌肉注射方式免疫小鼠。细胞因子结果表明Trap蛋白免疫组的细胞因子IFN-γ分泌水平明显高于标签蛋白pET-32a免疫组，这说明Trap蛋白能促进Th0向Th1方向分化，显著提高了机体的细胞免疫应答，同时，Trap蛋白免疫组的IL-4表达水平也显著提高，这说明Trap蛋白显著提高了机体的体液免疫应答。抗体水平检测结果表明Trap蛋白免疫组的特异性IgG表达水平明显高于标签蛋白pET-32a免疫组，其中Trap蛋白免疫组的IgG1与IgG2b表达水平显著高于标签蛋白pET-32免疫组，说明Trap蛋白诱导机体产生了良好的体液免疫应答，Trap蛋白免疫组的IgG2a显著高于pET-32免疫组，说明Trap蛋白引起的细胞免疫应答也高于标签蛋白pET-32a免疫组。

在对小鼠进行攻毒后，检测金黄色葡萄球菌在小鼠各个脏器的定植量发现，Trap蛋白能显著降低细菌在肝、脾、肺、肾中的定植，在病理组织切片的观察中同样发现Trap蛋白减轻了金黄色葡萄球菌对小鼠各个脏器的损伤，最终，Trap蛋白对小鼠的免疫保护率为56%，其综合免疫结果高于其他抗原诸如Isd B，Isd A等[23]。但是，我们也意识到了现在研究的局限性，Trap蛋白疫苗仅仅是在败血症模型中发挥着良好的作用，对于其他模型比如肺炎模型，乳房炎模型等是否也同样具有良好的保护作用，还需进一步的研究说明。