谷子白发病菌最适侵染条件及接菌技术研究

闫鑫，王鹤，黄国丽，王慧娜，韩渊怀，3，王海岗，郭龙，韩彦卿，3*

（1.山西农业大学 植物保护学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801；3.杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室；山西 太原 030031；4.山西省农业科学院 农作物品种资源研究所，山西 太原 030031；5.山西临汾市浮山县农业农村和水利局，山西 浮山 042600）

谷子是我国重要杂粮之一，在旱作生态农业、食物多样性和“健康中国”工程中占有举足轻重的地位［1］。近年来，随着秸秆还田以及单一同质化谷子品种的广泛种植，谷子多种病害发生且呈逐年加重趋势，自2010 年以来，白发病已成为谷子生产上最严重的病害之一［2］，该病害频繁严重发生对谷子的产量和品质都构成极大的威胁，培育抗病品种是最有效的防治方法［3］，而明确其侵染条件与接种方法是研究白发病的基础，是培育抗病品种的前提。

目前，关于谷子白发病的研究主要集中在谷子抗病生理生化［4］以及抗病基因的挖掘［5］，对白发病菌的发病条件研究尚少，国内仅少数学者对白发病菌萌发及侵染进行了初步的研究。王珍海［6］认为卵孢子的适宜萌发温度为8~20 ℃，相对湿度为20%~80%；刘学敏等［7］研究表明，辣椒疫霉菌侵染的最适土壤温度为22 ℃，最适土壤含水量为40%左右；张则君等［8］等发现，温湿度以及幼芽出土快慢会影响谷子白发病的发生，温度低时，幼芽出土较慢，有利于白发病菌侵染幼芽，湿度大时，有利于孢子萌发侵染，低温高湿有利于白发病的发生。2013 年榆林市［9］由于雨水频繁，低温高湿的气候条件，为田间该病原菌的萌发和侵染提供了有利条件，使得白发病的发病率急剧上升，有的地块甚至达到55.0%，严重制约了谷子产业的发展。

建立稳定高发的接菌技术对研究白发病具有非常重要的意义。张秦风［10］采用白发病菌孢子囊悬浮液对分蘖幼芽、幼叶和幼苗等进行接菌，接菌的植株出现明显发病症状；Paola 等［11］研究可可黑果病原菌棕榈疫霉的接菌方法，对土壤接种、叶面喷洒以及琼脂圆盘接种叶片3 种接菌方法比较，其研究发现，琼脂圆盘法接种96 h 后植株叶片发病率为100%，而叶片喷洒法与土壤接菌法接种后10 d 未发现明显的症状，表明琼脂圆盘法更适合棕榈疫霉的接种。

本研究拟采用卵孢子拌种的方法，通过不同温度处理卵孢子，明确不同温度处理对卵孢子侵染谷子的表型差异；探索卵孢子侵染感病谷子品种最适温度和湿度环境条件。同时进行卵孢子拌菌接种，以及改进Paola 的土壤接菌法和琼脂圆盘接菌法，用孢子囊悬浮液进行浸根，叶片喷洒以及离体叶片接菌，调查发病率，结合统计学分析，以期筛选出高效稳定的接菌方法；为谷子抗性鉴定及白发病菌致病分子机制研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为高感品种晋谷21（JG21），由山西农业大学生物工程研究所种质资源库提供。

1.2 试验方法

1.2.1 白发病菌的收集与培养

孢子囊悬浮液的制备。采集“灰背”症状的叶片，用无菌水轻轻冲洗，洗去叶片背面的霉层，在超净工作台中用75%乙醇，10% NaClO 进行表面消毒后，无菌水冲洗2~3 次，每次1 min，在无菌滤纸上晾干［12-13］，用镊子将表面消毒后的“灰背”症状叶片置于含有1%水琼脂培养基的培养皿中，在20 ℃条件下黑暗培养16 h，待叶片背面长出新鲜的霉层，随后用灭菌刷将孢子囊刷入无菌水中，制成孢子囊悬浮液，用血球计数板［14］将孢子悬浮液的浓度调为105个·mL-1［15］，备用。

卵孢子的获得。田间大量采集的谷子发病植株的“发丝”，晾干后，过筛［16］。为了避免卵孢子表面粘附杂菌，采用10% NaClO 消毒2 h，75%酒精消毒30 min，无菌水充分振荡冲洗3~5 次，晾干，备用。

1.2.2 白发病菌的侵染条件

（1） 不同温度处理卵孢子对谷子的侵染

称取消毒处理后的卵孢子各0.1 g，分别放在-18、4、15、20、25 ℃的培养条件下处理36 h。将不同温度处理后的卵孢子与谷粒拌种（卵孢子与谷粒混合比例为1∶10），播种于育苗盘中，每盘70穴，以无菌水拌种为对照组，待谷子长至两叶一心期时，分别测定其发芽率，形态指标，发病率，随后使用叶绿素仪测定谷子倒二叶的相对叶绿素含量。

（2） 不同温度和湿度处理后谷子发病率调查

将谷粒与卵孢子拌种，卵孢子与谷粒混合比例为1∶10（质量比），播种于育苗盘中，每盘70 穴，并设置无菌水拌种为对照组，光照培养箱温度分别设置15、18、20、23、25 ℃五个梯度，湿度设置60%、70%、80%、90%、100% 五个梯度，6 d 后，测定苗期病株率。

1.2.3 白发病菌不同接种方法

离体叶片接菌法。室内离体叶片接菌法参照韦洁玲等［17］的方法，将两叶一心期谷子叶片表面消毒，置于灭菌的湿润滤纸上，用移液器接种5 μL孢子囊悬浮液于叶片背面，无菌水为对照，设置3个生物学重复，20 ℃黑暗培养12 h，随后在温度20 ℃下光照（16 h）和黑暗（8 h）条件下培养，6 d 后观察其发病情况，并计算其病情指数，病情指数大于80，即为高感品种［18］。

幼苗喷雾法。待谷子长到两叶一心期时，均匀喷洒0.1%的Tween-20［19］，再喷洒孢子囊悬浮液，每隔4 h 喷洒一次，连续喷洒3 次，以无菌水做对照，统计苗期发病率。

浸根法接种。选取谷子幼根长度基本一致的谷苗，将根部浸入孢子囊悬浮液中，以无菌水处理为对照，浸根时间设置为1、2、4、6 h 共4 个梯度，随后移栽到灭菌后的土壤中，每组3 个生物学重复。定植6 d 后，调查统计总株数及存活率。

1.3 调查统计方法

参照本实验室制定的病害分级标准，记录发病叶片数及其病级情况。叶片基本无症状，0 级；病斑占叶片面积<5%，1 级；5%≤病斑占叶片面积<10%，3 级；10%≤病斑占叶片面积<25%，5级；25%≤病斑占叶片面积<50%，7 级；病斑占叶片面积≥50%，9 级。各个指标计算公式如下［20-22］。

参 考Stewart 等［23］和Abramoff 等［24］的 方 法 使用Image 拍 照，使 用IBM SPSS Statistics22 进 行 统计学分析，使用新复极差法进行显著性分析。

“芽死”率的测定方法。未出苗的种子挖出，将种子置于体式显微镜下观察，区分“芽死”与不发芽的种子，分别记录。“芽死率”按照“芽死数”占总播种种子数（剔除掉未萌发的种子）的百分比。

2 结果与分析

2.1 不同温度处理卵孢子对JG21 发芽率的影响

5 个不同温度处理组的谷子发芽率均显著低于不接菌的对照组（图1）。未接菌组发芽率均达到90%以上，处理组中−18 ℃处理卵孢子后谷子发芽率最高，可达84.67%，随着温度的升高，其出苗率呈现下降的趋势，20 ℃处理下发芽率最低，仅达到30%，25 ℃时，其出苗率又呈现上升的趋势；对“芽死”发生率统计发现，未处理组“芽死”发生率普遍低于3%，5 个不同温度处理组的“芽死”发生率均显著高于对照组，−18 ℃处理下的“芽死”发生率均低于其它4 个处理组，随着温度升高，其“芽死”发生率呈现上升的趋势，20 ℃处理的“芽死”率最高，达到67.94%，25 ℃出现下降的趋势。综上，20 ℃处理卵孢子拌种的JG21 发芽率最低。

图1 不同温度处理卵孢子拌种JG21 出苗率Fig.1 Effect of oospores treated at different temperature on germi⁃nation rate of JG21

2.2 不同温度处理卵孢子对JG21形态指标的影响

通过不同温度处理的卵孢子接种感病品种JG21 后测定处理组和对照组谷子植株的株高，茎粗，以及倒二叶的叶宽，叶长等形态指标，结果表明，处理组的数据均显著低于对照组（图2），其中20 ℃处理的株高，叶长，叶宽与茎粗均为最低，分别为8.80、4.40、0.21、0.77 mm，与对照组28.43、24.58、0.86、2.23 cm 相比均显著的下降，各个形态指标表现出从−18 ℃到20 ℃基本呈现先下降，后上升的趋势。结果表明20 ℃处理卵孢子后谷子的株高，茎粗，以及倒二叶的叶宽，叶长等形态指标均低于正常植株，说明20 ℃处理的卵孢子对JG21 形态指标的影响最大。

图2 不同温度处理卵孢子侵染JG21 后形态指标差异Fig.2 Differences in morphological indexes of oospores infected with JG21 at different temperature

2.3 不同温度处理卵孢子JG21 相对叶绿素含量

卵孢子侵染谷子后发病叶片会褪绿变黄或者黄绿相间的条纹症状，为明确卵孢子侵染对叶绿素含量的影响，使用SPAD 仪测定不同处理组与对照组叶片的相对叶绿素含量。测定结果表明（图3），接菌的处理组的叶片SPAD 值均显著低于不接菌的对照组，未接菌组的SPAD 值均高于23，20 ℃处理温度下，所测得的SPAD 值最低，为12.36，−18 ℃处 理 条 件 下，SPAD 值 最 高 为17.12。综合分析，5 个不同温度处理组的卵孢子均可萌发且侵染植株，造成叶片出现“褪绿”现象，但是20 ℃处理下，叶绿素相对含量最低，“褪绿”现象最明显。

图3 不同温度处理卵孢子对JG21 相对叶绿素含量的影响Fig.3 Effects of oospores treated at different temperature on JG21 on chlorophyll content

2.4 不同温度处理卵孢子对JG21 发病率的影响

由图4 可见，−18 ℃处理的植株发病率最低，为1.51%，其余4 个处理组植株发病率明显高于不接菌的对照组（11.83%），其中20 ℃处理卵孢子后，植株发病率最高，可达86.67%；而4、15、25 ℃温度处理下植株发病率在22.60%~64.30% 之间。结果表明，经20 ℃处理后的卵孢子对植株的侵染最严重，发病率最高。

图4 不同温度处理卵孢子对JG21 发病率的影响Fig.4 The effect of different temperature treatment of oospores on the incidence of JG21

2.5 谷子苗期白发病高发的最适温湿度条件

通过卵孢子拌菌法，明确谷子苗期最适发病温湿度。采用设置不同温度和湿度处理（图5），对照组发病率均低于5%，处理组随着温度的逐渐递增，病株率逐渐升高，23~25 ℃时病株率最高，可达85%以上。温度低于20 ℃时，苗期病株发生率明显呈现下降趋势；谷子苗期设置相对湿度80%及以上时，未拌菌组发病率普遍低于5%，处理组苗期病株发生率显著提高，相对湿度100%时，苗期病株发生率可高达到97%。由此可知，采用卵孢子拌菌法接菌时，苗期发病的最适温度为23℃~25℃，最适湿度为80%以上。

图5 不同温湿度下苗期发病率差异Fig.5 Differences in incidence rates under different temperature and humidity

2.6 不同接菌方法比较

为探索谷子白发病最佳接菌方法，本研究采用卵孢子拌种，孢子囊悬浮液离体叶片接菌、喷雾接菌和幼苗浸根等4 种接种方法进行比较，摸索稳定高效的接菌技术。结果表明，采用卵孢子拌种法，相对湿度为80%~100%，温度为23~25 ℃时，其发病率可高达98.5%（图6A），表明卵孢子拌种法是非常有效、可靠的接菌方法。孢子囊悬浮液离体叶片接菌，计算叶片背面的病斑面积以及占叶片总面积的比例，并进行统计学分析，病情指数为84.4（图6B）。谷子两叶一心期，用孢子囊悬浮液浸根法进行接种（图6C），处理时间1~4 h 之间，植株的存活率呈现出下降的趋势，浸根4 h 时存活率最低，为3%，且处理组植株的存活率（3%）显著低于对照组（83.57%）。随着时间的延长，6 h 时，植株的存活率出现了上升趋势，其存活率达到20%，但处理组植株的存活率（20%）同样显著低于对照组（87%），表明孢子囊悬浮液浸根4 h 时，是浸根法最佳的接菌时间点。幼苗在两叶一心时，孢子囊悬浮液喷洒叶片接菌，8 d 后，处理组谷子幼苗的发病率达到70%（图6D），且发病率明显高于未接菌植株的发病率（2.5%，1.25%，5%）。综上所述，卵孢子拌种的接菌方法明显优于其它3种接菌方法，为最高效的接菌方法。采用孢子囊悬浮液接菌时，其中，叶片喷洒法的发病率最高，离体叶片接法次之。喷洒法和离体叶片接菌可作为室内高效的接菌方法。

图6 卵孢子拌种、孢子囊悬浮液离体叶片接种、喷雾法和幼苗浸根法接种后发病率比较Fig.6 Comparison of incidence of seed dressing with oospores，in vitro inoculation

3 讨论

分析和明确病原物侵染植株的各个影响因子，对研究植物病害以及对其的预防具有重要意义［25-26］。谷子白发病的侵染机制尚不明确，侵染影响因素及接种方法的研究国内外鲜有报道。本研究使用卵孢子拌种的方法，明确了20 ℃处理的卵孢子对谷子的侵染最严重，说明温度对卵孢子的萌发率可能存在一定的影响。通过设置不同梯度温度和湿度条件，研究发现相对湿度为80%~100%，温度为23~25 ℃时，白发病的发生率最高。刘若妍等［21］对葡萄叶片进行离体接菌，明确了葡萄霜霉病在环境湿度为75%，保湿3 h 后便会出现发病症状；Koopman 等［27］研究表明，葡萄霜霉病菌的孢子囊产生的最适条件为湿度95%以上，温度在20~25 ℃之间；这些与本研究结果相一致，但康立功等［28］通过对番茄芝麻斑病菌侵染条件的研究，结果表明25~30 ℃是病原菌侵染的最佳温度；此结果与本研究结果不符，可能是因为番茄芝麻斑病菌为半知菌亚门，与白发病菌表现出不同的生物学特性。同时，2017 年建平县白发病发生严重，研究学者经分析推测该地区连续降雨量较多，为病原菌的侵染提供了良好的湿度和温度条件所致［29］。2001 年太原由于降雨偏多，导致白发病发生严重，与本研究的结果表现出一致性［8］。

本研究通过有性卵孢子和无性的游动孢子进行白发病菌的接种方法比较，研究发现卵孢子拌种的发病率最高，可作为稳定的接种方法。张海旺［30］认为离体叶片划伤接种法为最稳定的检测方法，而活体喷雾接种、叶片无划伤接种会出现假抗性且不同叶龄期的反应型会出现不一致性；刘森、袁庆华［31-32］等均采用人工离体接种法进行接菌，表现出良好的重复性。本研究采用离体叶片接菌法，病情指数可达84.4%，该方法不仅操作简便，而且结果可靠，适合谷子种质资源对白发病抗性的快速鉴定。史文琦等［33］建立的小麦白粉菌分生孢子悬浮液喷雾接种方法，通过控制悬浮液中孢子浓度，有效的控制接种量，避免人为的误差；本研究采用的孢子囊悬浮液喷洒接菌，发病率较高，可达73%，也可作为一种可靠、高效的苗期接种方法。此外，本研究还建立了卵孢子拌种以及孢子囊悬浮液浸根两种白发病菌的接菌技术，孢子囊悬浮液浸根法可使幼根直接接触病原菌，且避免了采用孢子囊悬浮液浸入土壤接菌导致孢子囊分布不均引起的误差；在本研究中，采用粘附剂进行卵孢子拌种，一方面保证卵孢子与谷粒充分粘附，另一方面可以保证其发病所需的湿度，更有利于白发病菌的侵染和发生。

4 结论

本试验中，20 ℃处理的卵孢子对谷子的侵染最严重；湿度是谷子白发病菌侵染的必要条件，在相对湿度为80%~100%，温度为23~25 ℃时，白发病的发生率最高。因此，可以通过控制温湿度降低该病害的发生。本研究建立的卵孢子拌种法，成功率高达95%以上，可以作为一种稳定高发的接菌方法；孢子囊悬浮液接菌，可精准的控制接种量，减少误差；离体叶片接菌法具有良好的重复性，可为谷子种质资源的抗病性鉴定提供可靠的结果。