大麦虫粉对黄羽肉鸡生产性能、肠道结构和菌群组成的影响

余亲平，黄静宇，张翠萍，刘 静，黄远彬，俞 婷，张晓爱，王 蕾，陈进胜，陈文卿，王志林，陈 庄，容 庭

(1.广东省农业科学院农业生物基因研究中心，广东省农作物种质资源保存与利用重点实验室，广州 510640；2.广州智特奇生物科技股份有限公司，广州 510700；3.广东海大集团，广州 511400；4.广东虫虫生物科技有限公司，广州 511462；5.饶平县动物卫生监督所，潮州 515700；6.广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，广东省动物育种与营养公共实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广州 510640)

大麦虫属于鞘翅目拟步甲族昆虫[1]，是中国近年从东南亚国家引进的资源型昆虫。大麦虫含有抗菌肽、有机酸等化合物，在抗菌消炎、改善免疫系统机能等生物活性方面有着巨大的潜在价值，有待深入开发利用。研究表明，病原真菌白僵菌感染大麦虫后，表达具有抗真菌活性的肽——Tenecin 3，可激发自身防御机能[2]。Benzertiha等[3]研究发现，大麦虫幼虫粉能显著提高肉鸡免疫力，同时有效降低沙门氏菌和大肠杆菌感染。Islam等[4]用肠炎沙门氏菌KCTC2021和大肠杆菌KCTC2571的混合物攻毒试验也进一步证明，攻毒后，在饲粮中添加0.4%大麦虫干虫粉或0.4%大麦虫发酵虫粉，发现大麦虫干虫粉和大麦虫发酵虫粉均可提高肉鸡的平均日增重(ADG)、免疫球蛋白G(IgG)和IgA水平。大麦虫营养丰富，可作为动物脂肪和高蛋白源饲料[5-6]，改善动物生长性能、养分消化吸收、抗氧化功能和机体健康。Sankian等[7]用大麦虫粉部分替代饲粮中鱼粉，可显著降低斑鳜鱼血浆总胆固醇含量，显著提高血清溶菌酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，对机体健康有一定的促进作用。同样，在饲粮中用大麦虫油全部替代豆油，对肉鸡养分消化率无不利影响[8]。大麦虫能够改善断奶仔猪的生长性能和营养物质消化，可作为断奶仔猪饲粮中鱼粉的替代蛋白质来源[9]。 在肉鸡饲粮中添加少量(0.2%、0.3%)黄粉虫和大麦虫粉作为蛋白质来源，也起到提高肉鸡生长性能的作用[3]。但国内外对有关大麦虫粉作为黄羽肉鸡的一种蛋白质需求，尤其是饲粮中添加大麦虫粉对黄羽肉鸡生长性能、肠道结构和菌群组成的影响鲜见报道。因此，本试验拟通过研究大麦虫粉对黄羽肉鸡生长性能、肠道结构和菌群组成的影响，以期为在黄羽肉鸡生产中应用大麦虫提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及仪器 大麦虫粉购自广东虫虫生物科技有限公司，其常规营养成分及抑菌活性见表1；MH肉汤与琼脂培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司；QIAGEN DAN提取试剂盒购自上海拜力生物科技有限公司。高压灭菌锅(HVE-50)购自Hirayama公司；低温冷冻离心机(Rotina 420R)购自Hettich公司；旋转蒸发仪(RV10 Basic)购自上海鹰迪仪器设备有限公司；电热恒温培养箱(DHP-9052)购自上海申贤恒温设备厂；荧光正置显微镜(YKY-700)购自上海永科光学仪器有限公司；NanoDrop 2000分光光度计购自Thermo Fisher Scientific公司。

表1 大麦虫粉营养成分(干物质基础)

1.1.2 试验动物与分组 广东省农业科学院基因中心微生物研究室前期试验结果表明大麦虫粉脂类提取物具有明显抑菌作用(表2)。鉴于此，本研究进行后续的大麦虫粉对黄羽肉鸡生产性能、肠道结构和菌群组成影响的试验研究。选用初始体重为(30.03±0.23) g的1日龄健康黄羽肉鸡216只，随机分成对照组、1%大麦虫粉组、3%大麦虫粉组3个处理组，分别饲喂基础饲粮、基础饲粮+1%大麦虫粉及基础饲粮+3%大麦虫粉3种饲粮。每组6个重复，每个重复12只。各组饲粮营养水平相同。试验期为63 d。

表2 大麦虫粉抑菌活性

1.2 试验饲粮与饲养管理

根据《中华人民共和国农业行业标准NY/T 33-2004.鸡饲养标准》设计黄羽肉鸡饲粮配方和营养水平(表3～5)。试验前做好鸡舍卫生和消毒工作，试验鸡自由采食和饮水，按常规免疫程序免疫。

表3 1～21日龄黄羽肉鸡饲粮组成与营养水平

表5 43～63日龄黄羽肉鸡饲粮组成与营养水平

续表

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长性能、各肠段长度测量 分别在21、42和63日龄统计试验鸡的体重和耗料量，计算平均日增重、平均日采食量、料重比；称重后每个重复选取1只鸡屠宰采集十二指肠、空肠、回肠、盲肠肠段，并在冰上摆直，用皮尺测量各肠段长度。

平均日增重(g/d)=(试验末平均体重-试验初平均初重)/试验天数

平均日采食量(g/d)=总采食量/(试验鸡数×试验天数)

料重比=总耗料量/总增重量

死淘率(%)=(期初鸡数-期末鸡数)/初始鸡数×100%

1.3.2 肠道黏膜形态分析 63日龄时，每重复中挑选1只鸡进行屠宰。取十二指肠近端5 cm处、空肠中段和回肠中段约1 cm，用PBS轻轻漂洗肠道内容物后，先在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后用70%乙醇室温下保存。将固定好的肠道样品经水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋等处理后，在室温下切成约6 μm厚的切片，苏木精-伊红染色。中性树脂封片，树脂凝固后，将载玻片装盒。在荧光正置显微镜下观察切片，每个肠段选取6个视野，测量视野中绒毛高度及隐窝深度，并计算绒毛高度/隐窝深度的比值。

1.3.3 肠道微生物16S rDNA测序分析 63日龄时采集黄羽肉鸡回肠中段内容物和盲肠内容物用于肠道微生物16S rDNA测序分析。高通量测序部分委托天津诺禾致源科技股份有限公司完成，具体操作方法如下：①采取QIAGEN微生物DNA提取试剂盒抽提内容物中的微生物DNA，用NanoDrop 2000分光光度计检测DNA的浓度，并调整DNA模板浓度及纯度至D260 nm/D280 nm=1.8～2.0，用于制备DNA文库；②DNA文库制备：根据所扩增的16S区域特点，构建小片段文库，采用PCR扩增一步法进行建库，扩增16S rDNA基因的V4区域，V4扩增引物520F/802R，引物用PAGE方法纯化；③基于Illumina NovaSeq 测序平台对该文库进行双末端测序(Paired_End)；④测序得到的原始数据(Raw Data)，存在一定比例的干扰数据(Dirty Data)，为使信息分析的结果更加准确、可靠，首先对原始数据进行Reads拼接过滤得到有效数据(Clean Data)，然后基于有效数据进行OTUs(operational taxonomic units)聚类进行物种注释，采用BugBase软件中Alpha多样性和Beta多样性分析进行菌群组成差异及丰度分析，根据物种注释结果，选取每个样本或分组在各分类水平上相对丰度较高的物种及其比例。

1.4 统计分析

试验数据用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(One Way-ANOVA)，采用Tukey’s法进行多重比较，结果以平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 添加大麦虫粉对黄羽肉鸡生产性能的影响

2.1.1 添加大麦虫粉对1～21日龄黄羽肉鸡生产性能的影响 由表6可知，与对照组相比，1%和3%大麦虫粉组平均日增重、21日龄体重、平均日采食量、料重比和死淘率无明显变化。

表6 1～21日龄黄羽肉鸡生产性能

2.1.2 添加大麦虫粉对22～42日龄黄羽肉鸡生产性能的影响 由表7可知，与对照组相比，1%和3%大麦虫粉组平均日增重和42日龄体重均显著增加(P<0.05)，料重比显著降低(P<0.05)；平均日采食量和死淘率均无显著差异(P>0.05)。

表7 22～42日龄黄羽肉鸡生产性能

2.1.3 添加大麦虫粉对43～63日龄黄羽肉鸡生产性能的影响 由表8可知，与对照组相比，1%大麦虫粉组63日龄体重显著增加(P<0.05)，3%大麦虫粉组63日龄体重增加，但差异不显著(P>0.05)，比对照组分别增加5.11%和3.13%；3%大麦虫粉组平均日采食量显著降低(P<0.05)；平均日增重和料重比均无显著差异(P>0.05)。3组43～63日龄的死淘率均为0。

表8 43～63日龄黄羽肉鸡生产性能

2.2 中添加大麦虫粉对黄羽肉鸡消化道长度的影响

由表9可知，与对照组相比，21日龄时，1%和3%大麦虫粉组盲肠长度均显著增加(P<0.05)；其他指标均差异不显著(P>0.05)。42日龄时，3%大麦虫粉组十二指肠长度显著增加(P<0.05)，其他指标差异不显著(P>0.05)。63日龄时，各处理组十二指肠、空肠、回肠和盲肠长度差异均不显著(P>0.05)。

表9 21～63日龄黄羽肉鸡肠道长度

2.3 添加大麦虫粉对黄羽肉鸡肠道绒毛高度和隐窝深度的影响

由表10可知，63日龄时，对照组和1%大麦虫组十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度、隐窝深度和绒隐比差异均不显著(P>0.05)。

表10 63日龄黄羽肉鸡肠道绒毛高度与隐窝深度

2.4 大麦虫粉对黄羽肉鸡肠道菌群组成的影响

由表11可知，63日龄时，1%大麦虫粉组回肠优势菌属是乳杆菌属、罗氏杆菌属和拟杆菌属；1%大麦虫粉组盲肠优势菌属依次是拟杆菌属、Alistipes属和乳杆菌属。与对照组相比，1%大麦虫粉组回肠中乳杆菌属、拟杆菌属和Alistipes属比例上升，罗氏杆菌属下降；1%大麦虫粉组盲肠中拟杆菌属和Alistipes属比例上升，乳杆菌属和罗氏杆菌属下降。

表11 黄羽肉鸡肠道菌群组成

3 讨 论

3.1 添加大麦虫粉对黄羽肉鸡生产性能的影响

据报道，目前世界上可用作动物饲料的昆虫有500多种。饲料中添加昆虫粉对肉鸡能产生积极的影响。利用超临界CO2萃取获得的黄粉虫油和大麦虫油可以完全替代肉鸡饲粮中的大豆油，对肉鸡的生长性能和消化率无不利影响[10]。研究表明，用大麦虫粉替代肉鸡饲粮中的豆粕可增加平均日增重，提高饲料转化率[3,10]。大麦虫粉代替饲粮中25%和50%的豆粕可提高鹧鸪60日龄时的体重[11]。Piccolo等[12]用大麦虫粉代替鲷鱼中的鱼粉，饲粮中大麦虫粉的含量达25%时，对鲷鱼体重增加、粗蛋白质消化率没有负面影响，相反，当饲粮中大麦虫粉的含量为50%时，对鲷鱼营养物质的消化率有负面影响。本研究结果显示，与对照组相比，1%大麦虫粉和3%大麦虫粉都提高黄羽肉鸡体重，比对照组分别增加5.11%和3.13%,其中1%大麦虫组试末均重显著高于对照组。Benzertiha等[10]在肉鸡饲粮中添加各比例的大麦虫全脂粉，可显著提高试末均重，其中0.3%大麦虫全脂粉组的体重比对照组增加7.11%。本试验结果与以上研究一致，说明添加适量大麦虫粉可以提高黄羽肉鸡的生产性能。

3.2 添加大麦虫粉对黄羽肉鸡肠道形态结构的影响

Loponte等[11]研究发现，饲粮中添加大麦虫增加肠道总长度和盲肠长度。本研究结果表明，饲粮中添加大麦虫粉显著增加黄羽母鸡盲肠和十二指肠长度。绒毛高度与隐窝深度反映小肠消化吸收能力，绒毛越高，隐窝越浅，小肠对营养物质的消化吸收能力就越好[13]。绒毛越高，肠道与营养物质的接触面积变大，有利于对营养物质的消化吸收；隐窝深度代表了肠上皮细胞的分裂速度，隐窝变浅，表明细胞的成熟率上升，分泌功能增强[14]。Biasato等[15]研究发现，饲粮中添加大麦虫粉对肉公鸡肠道形态和组织学结构没有显著影响。Biasato等[16]也发现饲粮中添加大麦虫粉对白羽肉母鸡(Ross 708)肠道形态结构无影响，与添加50 g/kg大麦虫粉组相比，150 g/kg大麦虫粉组绒毛高度显著降低，隐窝深度显著升高，绒毛高度/隐窝深度显著降低，对饲料转化效率和肠道形态产生负面影响，因此，低水平添加量可能更合适。本试验结果显示，饲粮中添加大麦虫粉对63日龄黄羽肉鸡小肠绒毛高度和隐窝深度的影响差异均不显著,与前人研究报道的结果一致[16]。Zadeh等[17]用大麦虫幼虫粉替代日本鹌鹑饲粮中的鱼粉和大豆油，结果表明大麦虫幼虫粉显著增加绒毛高度和隐窝深度，这可能与动物品种不同有关。

3.3 大麦虫粉对黄羽肉鸡肠道菌群组成的影响

动物肠道中拥有丰富多样的微生物，对动物的健康和生产中起重要作用。动物肠道微生物多样性及丰度受环境、饲粮、疾病、抗生素等影响。肉鸡(Ross 308公鸡)饲粮中添加大麦虫粉显著降低盲肠大肠杆菌和沙门氏菌含量，而粪便微生物群含量和盲肠和粪便消化液的pH未受影响[8]。盲肠微生物菌群评估显示，饲喂虫粉饲粮的肉鸡盲肠微生物Beta多样性发生了变化，虫粉添加量为15%时对肉鸡的盲肠微生物群产生负面影响[18]。作为蛋白质替代品，被机体消化后的大麦虫粉对肠道微生物菌群有积极的影响，通过增加和/或维持促进菌群的健康以及挥发性脂肪酸的产生(于试验48 h时，产生的乙酸和丙酸分别是阴性对照的1.7和2.6倍)[19]。用大麦虫粉代替饲粮中鱼粉后导致肠道细菌群落发生变化：Simpson优势度D指数增加了5倍，Shannon指数下降了近2倍，导致菌群S.aurata(占其所有OTU的62.2%)、D.labrax(占其所有OTU的60.0%)和O.mykiss(占其所有OTU的33.0%)比例增加[20]。本研究结果显示，与对照组相比，1%大麦虫粉组回肠中乳杆菌属、拟杆菌属和Alistipes属比例上升，罗氏杆菌属下降；1%大麦虫粉组盲肠中拟杆菌属和Alistipes属比例上升，乳杆菌属和罗氏杆菌属下降，说明大麦虫粉对回肠和盲肠肠道菌群都具有调节作用。

4 结 论

在饲料中添加1%大麦虫粉能够提高黄羽肉鸡的生产性能。肉鸡饲粮中添加1%大麦虫粉增加肠道长度和调节肠道菌群组成，有利于消化道发育。