西昌市某奶牛场犊牛腹泻的病原学检测

李 昊，周可磊，唐国强，陈世云，彭艳伶

（1.西昌学院动物科学学院，四川 西昌 615013；2.四川省凉山州动物疫病预防控制中心，四川 西昌 615050；3.四川省西昌市农业农村局，四川 西昌 615000）

犊牛腹泻一年四季均可发生，尤其以冬季和早春多发，且3 周龄以内的犊牛更容易发生［1］。导致犊牛腹泻的主要病因分病毒性、细菌性、寄生虫性和营养性，病毒感染是引起腹泻的重要原因且易引起系统损伤和免疫抑制，导致犊牛生产性能下降甚至死亡［2］。近年来，我国各个地区对犊牛腹泻的流行病学调查都有很多报道［3-5］，然而，针对四川省凉山州西昌市犊牛腹泻的病原调查未见报道。本次采集西昌市某奶牛场22 头有临床腹泻症状的犊牛腹泻粪便样本，对常见的重要病原进行检测，以摸清犊牛腹泻的病原种类和流行规律，为西昌市犊牛腹泻防控提供参考依据。

1 发病情况

该奶牛场于2020年先后进行了口蹄疫、牛出败、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒（BVDV）-牛传染性鼻气管炎（IBR）二联灭活苗的免疫，饲喂经巴氏消杀的抗生奶、代乳粉、诱食料。现有犊牛135头（未断奶犊牛83头），2021年1月犊牛发生腹泻（腹泻主要发生于30 日龄前，个别2 日龄也出现腹泻），现场调查腹泻犊牛22 头，发病率达16.30%。主诉该场发病率最高达40%，死亡率为10%。腹泻发生后，采用恩诺沙星注射液（肌注0.025 mL/kg）、磺胺间甲氧嘧啶注射液（肌注0.2～0.3 mL/kg）、土霉素片（内服15 mg/kg）进行治疗，但效果不佳。

2 材料和方法

2.1 样本采集 2021 年1 月对该奶牛场22 头腹泻犊牛逐一采集粪便样本，随后冷藏运输并储存在-80 ℃。

BCoV、BRV、BVDV、BNoV、NeV、BPV、BToV及大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等阳性毒（菌）株均由西南民族大学动物医学实验室提供。

2.2 主要试剂及仪器 Trizol 试剂RNAiso Plus（Code No.9109）、反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit（Code No.RR037A）、TaKaRa Ex Taq 酶、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ、Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）、6×DNA Loading Buffer、DL2000 DNA Marker、pMDTM19-T 克隆载体、感受态细胞E.coli DH5α Competent Cells等购于宝生物工程（大连）有限公司；胶回收试剂盒Gel Extraction Kit D2500 和质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I 购于Omega Bio-Tek 公司；氯仿、蛋白酶K、异戊醇、SDS（10%浓度）、STE等DNA提取常规试剂由西南民族大学动物医学实验室保存。仪器：紫外分光光度计Cary 50 Probe（Vatian 公司，美国）；凝胶成像系统Doc2000（Bio-Rad 公司，美国）；高速冷冻离心机TGL-16（蜀科公司，中国）。

2.3 核酸提取 取适量的粪便与灭菌PBS 缓冲液（pH 7.2）按1∶5的比例制成混悬液，置于-80 ℃超低温中反复冻融3次，于4 ℃台式高速冷冻医用离心机中以8 500 r/min离心10 min，取其上清液再用0.22 μm 微孔径过滤器过滤，过滤好的混悬液取300 μL 严格按照TrizolTMReagent 试剂盒说明书的方法提取样本总RNA，全程在4 ℃下操作（旨在保证所提取的核酸不被降解），提取的总RNA严格按照PrimeScriptTMRT Master Mix 试剂盒说明书的方法反转录成cDNA，置于-20 ℃冰箱中备用。另取过滤好的混悬液300 μL 加入STE 500 μL、SDS 和PKA 各20 μL 后水浴1～3 h 进行DNA 提取，提取后的细菌DNA 保存于4 ℃冰箱中备用。

2.4 细菌和病毒的PCR 和RT-PCR 检测 运用PCR和RT-PCR方法进行检测，所用引物均由上海生工生物科技有限公司合成，详细序列见表1。

表1 引物序列信息

3 结果

由表2、表3 可见，大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌均未检出；22 份粪便样本均检测到了BVDV（100%）；BNoV 阳性样本有16 份（72.73%）；NeV阳性样本有12 份（54.54%）；BRV 阳性样本有8份（36.36%）；BPV 阳性样本有4 份（18.18）；BCoV阳性样本有1 份（4.54%）；BToV 阳性样本有1份（4.54%）。BVDV 感染率达100%，说明该牛场BVDV 感染呈广泛流行，BNoV 和NeV 感染率次之。

表2 犊牛粪便样本检测结果

表3 犊牛粪便样本阳性率检测情况

检测结果表明，22 份犊牛粪便样本中除1 份样本只感染1种病毒外，其余21份样本均为混合感染，感染率高达95.45%。其中，有3 份样本感染了5种病毒（13.64%），有2份样本感染了4种病毒（9.09%），有8份样本感染了3种病毒（36.36%），其余8份样本感染了2种病毒（36.36%）。

4 讨论

病毒感染是引起犊牛腹泻的重要原因，这些病毒主要有牛轮状病毒（BRV）、牛冠状病毒（BCoV）、纽布病毒（NeV）、牛诺如病毒（BNoV）、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒（BVDV）、牛细小病毒（BPV）和牛环曲病毒（BToV）等。其中，BRV、BCoV、BVDV 能导致70%以上的新生犊牛发病，且死亡率高达50%，给养牛产业带来了巨大的经济损失［3］。细菌如大肠杆菌（E.coli）、沙门氏菌（Salmonella）、巴氏杆菌（Pasteurella）等也可引起犊牛腹泻。大肠杆菌、沙门氏菌、轮状病毒和冠状病毒等病原还是重要的人畜共患病病原［6-8］，可能对地区公共卫生安全造成严重威胁。

本试验对22 份犊牛腹泻粪便样本进行了PCR 和RT-PCR 检测，结果细菌性病原并未检测到，可能与该场犊牛群使用了抗生素药物有关；检 出BVDV、BNoV、NeV、BRV、BPV、BCoV 和BToV 的阳性率分别为：100%、72.73%、54.54%、36.36%、18.18%、4.54%和4.54%。本结果表明，该场发生的犊牛腹泻由多种病毒混合感染所致，感染率达95.45%，这与美国之前的报道相似［9］。犊牛群中BVDV 感染率最高，达100%，BNoV和NeV 阳性率分别为72.73%、54.54%，表明BVDV、BNoV 和NeV 是该奶牛场犊牛腹泻的主要病原。此外，BRV 和BCoV 属于人畜共患病病原［8］，在防控BRV 和BCoV 的同时，应当做好饲养员自身的生物安全防护，防止出现公共卫生事件。

依照BVDV 的病毒基因序列差异，将其分为BVDV-1（Pestivirus A）、BVDV-2（Pestivirus B）和BVDV-3（Pestivirus H、HoBi-like Pestivirus and atypical ruminant Pestivirus），并且BVDV-1和BVDV-2 还包含不同的亚型［10］。全球范围内主要流行的2 个亚型为BVDV-1a 和BVDV-1b。有文献报道，BVDV-1b是我国牛群最优势流行毒株，且难以防控［11］。该奶牛场使用了BVDV-IBR二联灭活苗，感染率仍然高达100%，猜测可能与感染毒株的基因型不一致所致。现在国内外BVD 灭活疫苗大多数针对于BVDV-1 型，虽然BVDV-1型灭活疫苗免疫牛群后产生的抗体能与BVDV-2型产生部分交叉免疫，但对抵御BVDV-2 型强毒株的能力却不得而知［12］，对BVDV-3 型的免疫力尚未见报道。所以该场感染的BVDV属于哪一个基因型，需作进一步研究。

近年来，BNoV、NeV、BToV 作为新发腹泻病原，严重危害了我国牛群的健康，也越来越受到关注。王玥琳等［13］采用RT-PCR方法检测了我国5个省12个奶牛场的BNoV感染情况，结果显示粪便样本中BNoV的检出率达25.81%。郭紫晶等［14］采用RT-PCR方法检测了我国6个省18个奶牛场的NeV感染情况，结果显示粪便样本中NeV的检出率高达48.1%。Li Hao等［15］采用RT-PCR方法检测了我国4个省5个奶牛场的BToV感染情况，结果显示粪便样本中BToV 的检出率达21.73%。这些都表明BNoV、NeV、BToV作为我国新发病原已经在国内广泛流行。本次检测结果表明，BNoV、NeV和BToV存在于该奶牛场中，一方面可能是由于管理人员对新发病原的了解重视程度低，在奶牛引种过程中未对其检测；另一方面可能是由于人为因素造成了交叉感染，造成多种肠道病毒协同作用，引起患病牛群腹泻病情加重，进而对犊牛腹泻的诊断和控制难度大大增加。因此，在养牛生产中，建议将这些新发腹泻病原纳入日常检测范围。