柴胡-白芍药对治疗2 型糖尿病的网络药理学作用机制研究

黄锦珠，殷 贝，毕艺鸣，范冠杰△

（1.广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510120； 2.广东省中医院内分泌科，广东 广州 510006）

《中国居民营养与慢性病状况报告（2015）》显示，我国成年人糖尿病的患病率为9.7%，60岁以上人群有所提高（近20%）［1］，预计到2045年，患者数将达1.198亿例［2］。对柴胡-白芍药对治疗2型糖尿病（T2DM）临床有效性的认知主要源于临床经验［3］，目前仍缺乏药理学研究解释其活性成分的作用机制。网络药理学以系统生物学理论为发展源头，通过选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计，体现了多靶点、多途径、多通路对生物效应的调节作用，有助于确认作用通路［4］及药物之间的相互作用［5］，现广泛运用于预测和辨识中药作用靶点及活性成分群，阐明作用机制，科学解释组方规律，发现新的适应证及活性化合物，与组学技术结合应用等多个方面［6］。本研究中拟对柴胡- 白芍药对的主要活性成分及T2DM 患者的基因进行筛选，建立药物-疾病关系网络，探讨柴胡-白芍药对与T2DM 的潜在关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 柴胡、白芍活性成分及靶点的挖掘与筛选

以中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）作为数据来源，将口服生物利用度（OB）和类药性（DL）作为参数，设OB ＞30%，DL ＞0.18，筛选并获得柴胡、白芍相关活性成分及对应靶点。

1.2 T2DM 相关基因获取

以“Diabetes Mellitus”为 关 键 词，在GeneCards（https：//www.genecards.org/）和NCBI 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行人类基因检索，剔除重复数据，统计出唯一基因。

1.3 药物-疾病核心靶点获取

将得到的柴胡- 白芍药对预测靶点与T2DM 的人类基因靶点取交集，即得柴胡-白芍药对作用于T2DM的预测靶点。利用Venny 2.1 软件，构建活性成分- 疾病作用靶点网络图，得到共有靶点，作为药物作用于疾病的预测靶点，进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

1.4 潜在靶点蛋白-蛋白相互作用分析

将筛选得到的柴胡- 白芍药对治疗T2DM 的预测靶点上传到String数据库（http：//cn.string-db.org/），选择“Homo Sapiens”，进行蛋白间相互作用分析，得到蛋白互作（PPI）网络，通过R 软件绘制PPI 网络关键靶点柱状图。将PPI 网络导入Cystoscape 3.6.0 中，通过Network Analyzer 软件进行拓扑分析，以介度、紧密度、度中心值、平均最短路径长度4 个参数为参考标准，通过“度中心值”排序，选取分值大于平均分的基因作为关键靶点。

1.5 MCODE 聚类分析

借助MCODE 网络分析工具的分析功能，选择关键基因。将PPI 网络导入Cytoscape 3.6.0 中，打开MCODE模块进行基因簇分析及核心基因筛选。

1.6 信号通路分析

通过String数据库对柴胡-白芍药对治疗T2DM的潜在靶点进行基因本体论（GO）功能富集分析和KEGG通路富集分析。将药物、疾病的共有靶点进行GO 的生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞组分（CC）富集分析，筛选校正P值≤0.05的项目，KEGG 通路富集分析同。预测柴胡-白芍药对治疗T2DM的潜在作用机制。

2 结果

2.1 活性成分

共收集到柴胡的化学成分349个，白芍的化学成分85个。同时满足OB和DL的柴胡活性成分17个，白芍活性成分13 个。剔除无靶点及重复活性成分10 个，共获得20个活性成分。详见表1。

表1 柴胡-白芍药对主要活性成分Tab.1 Main active ingredients of Bupleuri Radix-Paeoniae Alba Radix drug pairs

2.2 药物-疾病靶点

查找柴胡-白芍药对的20种有效活性成分对应的潜在靶点，剔除无效及重复靶点后，共得到185 个潜在靶点。经GeneCards 和NCBI 数据库汇总和剔重，共得1 669 个T2DM 靶点蛋白。将上述两类靶点进行交集处理，得104 个靶点，即为柴胡- 白芍药对治疗T2DM 的潜在靶点。详见图1。

图1 柴胡-白芍药对治疗2型糖尿病的药物-疾病靶点Fig.1 Drug-disease target of Bupleuri Radix-Paeoniae Alba Radix drug pairs for the treatment of T2DM

2.3 PPI 网络构建及拓扑分析

共筛选出45 个关键靶点，其PPI 网络图见图2。前20个靶点的柱状图见图3。PPI网络分析结果显示，平均节点度为31.4，节点度值排名前10 位的靶点为IL-6，AKT1，VEGFA，CASP3，IL - 1β，MAPK8，MMP9，JUN，PTGS2，CXCL8，这些靶点可能是柴胡- 白芍药对治疗T2DM的关键靶点。

图2 柴胡-白芍药对治疗2型糖尿病靶点的PPI网络图Fig.2 PPI network of Bupleuri Radix-Paeoniae Alba Radix drug pairs for the treatment of T2DM

图3 PPI网络关键靶点柱状图Fig.3 Histogram of key targets of PPI network

2.4 聚类分析

柴胡-白芍药对治疗T2DM靶点的核心基因见表2。共得到5 个基因簇和5 个核心基因，核心基因为GSK3B，NFKBIA，CAV1，VCAM1，SLC6A2。详见图4。

图4 柴胡-白芍药对治疗2型糖尿病的5个基因簇和5个核心基因Fig.4 Five gene clusters and five core genes of Bupleuri Radix-Paeoniae Alba Radix drug pairs for the treatment of T2DM

表2 柴胡-白芍药对治疗2型糖尿病靶点的核心基因Tab.2 Core gene of Bupleuri Radix-Paeoniae Alba Radix drug pairs for the treatment of T2DM

2.5 功能GO 富集分析

共 富 集 到2 055 条BP，136 项MF，47 项CC。详见图5。

图5 柴胡-白芍药对治疗2型糖尿病关键靶点GO功能富集分析结果Fig.5 GO functional enrichment analysis results of Bupleuri Radix-Paeoniae Alba Radix drug pairs for the treatment of T2DM

2.6 KEGG 通路富集分析

共富集到157条信号通路。详见图6。

图6 柴胡-白芍药对治疗2型糖尿病KEGG通路富集分析结果Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis results of Bupleuri Radix-Paeoniae Alba Radix drug pairs for the treatment of T2DM

2.7 中药-活性成分-疾病靶点网络构建

中药-活性成分-疾病-靶点PPI 网络见图7（网络中黄色为药物作用于疾病的靶点，蓝色为化合物，红色为疾病糖尿病，紫色为白芍、柴胡）。将活性成分筛选出来按程度值排列（值越大成分越重要），排前5位的依次是Quercetin（MOL000098）、Kaempferol（MOL000422）、Isorhamnetin（MOL000354）、β-Sitosterol（MOL000358）、Stigmasterol（MOL000449），每种均能与多个靶点相互作用。详见表3。

表3 活性成分信息Tab.3 Information of active ingredients

图7 柴胡-白芍药对活性成分与交集靶点相互作用网络图Fig.7 Interaction network of active ingredients and intersection targets of Bupleuri Radix -Paeoniae Alba Radix drug pairs

3 讨论

在我国，糖尿病已成为继肿瘤、心血管疾病后第三大严重影响患者身心健康的疾病［7］，中医以高疗效和少副作用的优势，在T2DM 的诊治中发挥着重要作用。肝气郁滞证因生活压力增大而越来越常见，肝郁日久会造成心理慢性应激、海马损伤，导致下丘脑-垂体-肾上腺轴功能亢进，促使促肾上腺皮质激素和糖皮质激素释放增加，血浓度升高，这些激素均有拮抗胰岛素功能的作用，还能引起胰岛B 细胞功能紊乱、脂肪因子分泌和微血管功能发生异常，从而导致胰岛素抵抗、血糖升高，最终导致T2DM 的发生［8］。故疏肝解郁法治疗T2DM得到临床认可，其中柴胡-白芍是常见药对。

柴胡- 白芍药对的主要活性成分可能为槲皮素、山柰酚、异鼠李素。槲皮素具有抗氧化、抗炎、降血糖、调血脂、降血压及免疫调节作用［9］。山柰酚可改善胰岛素抵抗和保护胰岛B细胞，还可通过抑制炎性反应和氧化应激减轻高血糖所致心脏损伤，降低心血管事件发生率［10］。异鼠李素通过激活骨骼肌细胞中JAK 2/STAT通路介导葡萄糖转运蛋白4易位来促进葡萄糖摄取，因此可能通过在生理浓度下预防高血糖而具有维持葡萄糖稳态的作用［11］。本研究中筛选出柴胡-白芍药对治疗T2DM 的靶点104 个，进一步佐证了中药治疗疾病具有多成分、多靶点协同作用的特点。

通过分析PPI 网络图发现，柴胡- 白芍药对与T2DM 关系密切，各靶点间有许多生物学联系，如蛋白质 水 平 的IL - 6，AKT1，VEGFA，CASP3，IL - 1β，MAPK8，MMP9，JUN，PTGS2，CXCL8 等。其中，IL - 6，IL- 1β，CXCL8 均为炎性因子。炎性反应是T2DM 重要的发病机制之一，其可能与导致胰岛素抵抗和胰岛B细胞损伤有关。VEGF 是作用于内皮细胞的促血管生长因子，据报道，VEGFA mRNA 可能改善血管病变，从而通过延缓糖尿病进程［12］。MAPK 属促分裂原活化蛋白激酶，通过降低其表达水平可减轻炎性反应，维持胰岛素的正常分泌，进而促进葡萄糖吸收。MMP9 主要参与了血管的再生及炎性反应等过程，其可破坏细胞组织、产生炎性反应而发挥促炎作用，且MMP9水平与其出现微血管病变及程度呈正相关［13］。本研究结果表明，柴胡-白芍药对可能通过减轻炎性反应，从而对T2DM 起到治疗作用，通过修复血管损伤而控制糖尿病及相关并发症的发生、发展。

KEGG 通路富集显示，AGE - RAGE 信号通路、流体剪切力及动脉硬化、IL - 17 信号通路、TNF 信号通路、乙型肝炎等是柴胡- 白芍药对发挥降糖作用的主要通路。T2DM及其并发症发生的重要原因之一是AGERAGE 下游信号转导通路的激活，导致大量促炎因子、促纤维因子释放，进而造成相应组织器官的损伤［14］。另外，FRANCISCO 等［15］研究发现，T2DM 患者外周血中CD3+T 淋巴细胞可产生大量IL-17 蛋白，而经过积极治疗的患者的血糖及IL - 17 水平均明显下降，说明IL- 17 信号通路可能在T2DM 发病过程中发挥重要作用。通过TNF 信号通路介导的炎性反应除了可引起胰岛素抵抗外，还可导致胰岛B 细胞损伤，最终导致胰岛功能衰竭。由GO 功能富集分析结果可见，以炎性因子升高为特征的慢性低度炎症与代谢异常密切相关，最终可引起T2DM 的发生、发展。而MCODE聚类分析结果提示，GSK3B，NFKBIA，CAV1，VCAM1，SLC6A2为柴胡-白芍药对治疗T2DM 的核心基因，均已被证明［16-18］可通过炎症通路导致糖代谢异常，进而影响血管病变，导致糖尿病足、糖尿病周围神经病变、糖尿病视网膜病变等的发生［19-20］，与PPI 网络中提示通过化合物干预炎性反应而控制糖尿病的结果相互佐证。

综上所述，柴胡- 白芍药对治疗T2DM 具有多靶点、多通路、多生物学成分发挥作用的治疗特点，其可能是通过影响炎性反应、改善血管病变等途径发挥降糖及延缓糖尿病进程的作用，但挖掘得到的信号通路间的生物关系和作用机制仍需大量试验数据支持。