不同产地黄芩主要化学成分含量及抗肿瘤活性比较研究

房佳敏，曾伟民，张彦龙

（黑龙江大学生命科学学院/黑龙江省普通高校微生物重点实验室，哈尔滨 150080）

0 引言

黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis）干燥的根，具有清热燥湿、泻火解毒等功效[1]。在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》中医治疗方案中[2]，推荐使用中药及中成药明确标注黄芩的配方和用量，双黄连口服液、清肺排毒汤中，黄芩是重要的原材料[3]。现阶段，黄芩在国内的需求量极大，也是出口到国外最多的药材之一[4]。

黄芩主产于黑龙江、辽宁、内蒙古、河北、河南、甘肃、陕西、山西、山东、四川等地[5]，目前，多以温带、热带等地区的黄芩为研究对象，而寒带地区的黄芩未见详细的阐述。黑龙江为寒带地区的代表，因具有独特地理环境及气候，所产黄芩的化学成分含量也较高。据报道，黑龙江省种植的黄芩15～16 t鲜品可提取1 t黄芩苷，而其他地区需要18～19 t左右提取1 t黄芩苷。黄酮类化学成分是黄芩中主要的活性成分，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素4种化学成分含量较高[6-8]。黄芩苷具有抗菌消炎[9-10]、降转氨酶[11]的作用，汉黄芩苷可以抑制癌细胞增殖[12-13]及转移[14]，黄芩素能够抑制多种细菌生长[15-16]，汉黄芩素具有抗癌[17-18]与利尿[19]的作用。黄芩的质量取决于活性成分的含量，且作为主要的参考指标[20]。肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，肺癌在全世界范围内的死亡率一直较高。已有研究证明，黄芩提取物是可以通过诱导肺癌细胞增殖、凋亡发挥抗肿瘤的作用，其作用机制为诱导细胞增殖、阻断细胞周期、清除癌细胞自由基，抑制肺癌的转移从而达到抑制NF-kB的活性[21]。

本实验采用HPLC技术测定黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素4种化学成分的含量，采用CCK-8试验探讨不同产地黄芩对肺癌细胞增殖的影响，分析不同产地黄芩中主要化学成分及抗肿瘤活性的区别，以期为寒地黄芩的开发及合理利用药用资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验时间、地点

实验于2020年11月—2020年1月在黑龙江大学生命科学学院211实验室进行。

1.2 仪器与试药

岛津LC-20A型高效液相色谱仪，岛津SPD-20A型紫外可变波长检测器，7725i手动进样器昆山KQ-500TDB型超声波清洗器，Milli-Q超纯水机，ML-T电子分析天平。

黄芩苷对照品（批号21967-41-9）、汉黄芩苷对照品（批号51059-44-0）、黄芩素对照品（批号491-67-8）、汉黄芩素对照品（批号632-85-9）均购自于南通飞宇公司，纯度均大于98%。甲醇、甲酸、乙醇、丙酮均为分析纯，购自于天津市富宇精细化工有限公司。山东、山西、甘肃3个产地的黄芩样品购自于豪州市盟桥药业有限公司，黑龙江的黄芩由黑龙江省勃利县海林药业公司提供。A549肺癌细胞系购自上海中科院细胞库，Cell Counting Kit-8试剂盒购置于北京碧云天公司。

4种不同产地的黄芩样品见表1，经鉴定为唇形科植物黄芩干燥的根，黄芩样品存放于阴凉干燥处，备用。

表1 黄芩样品

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件 Diamonsil-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5 μm）；检测波长274 nm；柱温40℃；流速0.8 mL/min，进样量20 μL；流动相为乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液（A），梯度洗脱见表2。

表2 乙腈B梯度洗脱顺序

1.3.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品0.0075 g、汉黄芩苷0.0025 g、黄芩素0.0010 g、汉黄芩素0.0005 g，放置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线，即得混合对照品溶液。

1.3.3 供试品溶液的制备

（1）制备供试品溶剂的筛选。目前多用乙醇、甲醇、丙酮进行黄芩样品的提取[22]。本研究选用70%乙醇、80%甲醇和60%丙酮对黄芩样品进行初筛，筛选出对4种成分提取效果较好的溶剂。

（2）供试品溶液的制备。精密称取黄芩粉末0.5 g，加入1.3.3（1）筛选出的溶剂40 mL于圆底烧瓶中，加热回流3 h，将其放冷，过滤，滤液置于100 mL容量瓶中，漏斗以及圆底烧瓶的残渣用1.3.3（1）筛选出的溶剂分次冲洗干净，洗液流入同一容量瓶内，最后加入1.3.3（1）筛选出的溶剂至刻度线，摇匀即得供试品溶液。

1.3.4 A549肺癌细胞培养 将A549细胞放置于RPMI-1640培养基中，37℃下在湿润的CO2培养箱中（5% CO2，95%空气）培养。

1.3.5 CCK-8试验 Cell Counting Kit-8试剂盒用于检测各产地黄芩抑制肺癌细胞的增殖。将96孔板中加入密度为5×105个细胞/mL的A549肺癌细胞过夜，以不同浓度的4个产地黄芩乙醇提取物（25、50、100、200、400 μg/mL）处理细胞，未加样处理为对照组，只加培养基且不加细胞为空白组。将处理好的细胞放置于CO2培养箱中37℃、5% CO2条件下培育24 h。将培育好的细胞每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃、5% CO2条件下培育1 h，酶标仪测定OD450。计算A549肺癌细胞的存活率，如式（1）。

1.3.6 数据处理 实验数据均重复3次，采用GraphPad Prism 6.0软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），各组之间采用Fishers LSD test进行多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 混合对照品溶液色谱图结果

如图1所示，黄芩苷对照品在41.338 min出峰，汉黄芩苷对照品在51.845 min出峰，黄芩素对照品在63.217 min出峰，汉黄芩素对照品在72.983 min出峰。

图1 混合对照品溶液色谱图

2.2 制备供试品溶剂筛选结果

从表3中可以看出，采用相同的提取方法，80%甲醇对4种化学成分的提取明显高于其他3种，因此选用80%甲醇作为实验提取溶剂。

该量表由Leary[15]编制，用于评定独立于行为之外的主观社交焦虑体验的倾向，共15条自陈条目，采用5级评分，得分越高，交往焦虑水平越高.国内由马弘[16]将其翻译成中文版.2004年彭纯子等[17]对其信效度进行了检验，内部一致性系数为0.81，重测系数为0.78，可以作为我国大学生社交焦虑研究的有效工具.

表3 3种溶剂提取结果 mV

2.3 供试品溶液色谱图结果

从图2中可以看出，各产地的4个化学成分与对照品的出峰时间依次对应，黄芩苷的峰面积最大，即在黄芩中的含量也较多，其次为汉黄芩苷。黄芩素、汉黄芩素的峰面积较小，在黄芩中的含量也较少。

图2 各产地黄芩色谱叠加图

勃利黄芩的黄芩苷峰面积最高，其次是山东莒县、甘肃定西，最后是山西运城。汉黄芩苷峰面积由大到小依次为黑龙江勃利、甘肃定西、山东莒县、山西运城。黄芩素峰面积由大到小依次为黑龙江勃利、山东莒县、山西运城、甘肃定西。汉黄芩素峰面积由大到小依次为黑龙江勃利、山西运城、山东莒县、甘肃定西。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取1.3.2中的混合对照品溶液，并将混合对照品溶液中黄芩苷配制浓度为750、600、450、300、150 μg/mL，汉黄芩苷配制浓度为 250、200、150、100、50 μg/mL，黄芩素配制浓度为100、80、60、40、20 μg/mL，汉黄芩素配制浓度为50、40、30、20、10 μg/mL，测定并记录峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。4种成分的线性回归方程、线性范围以及相关系数见表4。

表4 4种成分回归方程以及线性范围

2.4.2 精密度实验 取勃利地区黄芩供试品溶液按1.3.1色谱条件连续进样6次，测定并记录峰面积，计算各成分的相对标准偏差RSD值，得出黄芩苷RSD值为1.34%、汉黄芩苷RSD值为1.25%、黄芩素RSD值为1.59%、汉黄芩素RSD值为1.39%（n=6），说明该仪器的精密度良好。

2.4.3 稳定性实验 取勃利地区黄芩供试品溶液，放置0、2、4、8、12、24 h后按1.3.1色谱条件进行测定，记录各成分的峰面积并计算相对标准偏差RSD值，黄芩苷RSD值为1.37%、汉黄芩苷RSD值为1.55%、黄芩素RSD值为1.60%、汉黄芩素RSD值为1.42%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性实验 取勃利地区黄芩样品，精密称定后按1.3.3（2）方法平行制备6份供试品溶液，进样测定并记录峰面积，计算得出黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的质量分数平均值分别为149、24.35、1.56、0.55 mg/g，其黄芩苷RSD值为1.29%、汉黄芩苷RSD值为1.48%、黄芩素RSD值为1.56%、汉黄芩素RSD值为1.44%，说明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率实验 精密称取各对照品适量，加入到10 mg已知含量的勃利地区黄芩样品中，按1.3.3（2）方法平行制备6份供试品溶液，依据1.3.1色谱条件进行测定。结果（表5）表明各待测成分回收率良好。

表5 加样回收率实验结果（n=6）

续表5

2.4.6 样品含量测定 将各产地的黄芩样品，按1.3.3（2）方法平行制备3份供试品溶液，并依据1.3.1色谱条件进行测定，记录峰面积，按外标法计算4种成分的含量，结果如表6所示。

表6 样品含量测定结果（n=3） %

表6 结果表明，4个产地黄芩样品中有效活性成分黄芩苷含量由高到低表现为黑龙江勃利＞山东莒县＞甘肃定西＞山西运城，汉黄芩苷含量由高到低表现为黑龙江勃利＞甘肃定西＞山东莒县＞山西运城，黄芩素含量由高到低表现为黑龙江勃利＞山东莒县＞山西运城＞甘肃定西，汉黄芩素含量由高到低表现为黑龙江勃利＞山西运城＞山东莒县＞甘肃定西。由此可见，不同产地来源的黄芩样品中的效活性成分含量有显著差异，黑龙江勃利地区黄芩中的化学成分含量居4个产地首位，这与黑龙江勃利独特的地形地貌、气候条件以及土壤有关，特殊的自然环境条件造就了黑龙江勃利地区黄芩有效成分的积累[23]。

2.5 黄芩对A549肺癌细胞增殖的影响

图4 ～7的结果表明，A549细胞的存活与浓度呈现依赖性，随着浓度增加，A549细胞的存活率逐渐降低。勃利黄芩提取物在25 μg/mL与对照组相比有显著性差异，当浓度达到100 μg/mL时呈现极显著差异。莒县黄芩在25 μg/mL浓度时与对照组呈现显著性差异，200 μg/mL时呈现极显著性差异。当定西黄芩提取物浓度在25 μg/mL与对照组相比有显著性差异，100 μg/mL时呈现极显著差异。当运城黄芩提取物浓度在25 μg/mL与对照组相比有显著性差异，当浓度达到200 μg/mL时呈现极显著差异。

图4 勃利黄芩对A549细胞增殖的影响

图5 山东莒县黄芩对A549细胞增殖的影响

图6 甘肃定西黄芩对A549细胞增殖的影响

图7 山西运城黄芩对A549细胞增殖的影响

不同产地黄芩提取物对A549肺癌细胞的增殖均有抑制作用，并呈浓度依赖性，表明黄芩具有抗肿瘤的活性。结果显示，与对照品相比黑龙江勃利地区的黄芩对A549肺癌细胞的存活率抑制作用最明显，其次为山东莒县＞甘肃定西＞山西运城，这与各产地化学成分含量有关，化学成分含量越高，其活性作用越明显，抑制肺癌细胞的增殖效果越强，与表6中所得出的结果吻合。

3 讨论

国内种植黄芩的产地众多，栽培方式和生长环境也有较大差异[24]，不同产地黄芩中的黄酮类成分也有较大的差别。2015版《中国药典》规定，按干燥品计算，样品中的黄芩苷不得少于9.0%[25]，本实验所收集的4个产地得黄芩样品均达到要求。

不同产地的黄芩化学成分含量差异显著，与前人的研究结果一致。其原因与地域差异、气候条件、栽培方法及取样范围都有较大的关系。但前人的研究仅利用高相液相色谱法测定不同产地黄芩中化学成分含量的差异，未探究化学成分含量对其活性的影响。本研究采用CCK-8试验，检测不同产地黄芩提取物对A549肺癌细胞增殖情况的影响，此实验结果验证了其化学成分含量越多抗肿瘤活性越强，并为临床依据不同病症、不同产地合理的调整用药提供了一定的理论依据。

本研究对不同产地的黄芩样品测定的数量较少，对其活性研究只进行了CCK-8试验，在今后的研究中可以增加样品的数量，也可检测不同生产年限和野生品的寒地黄芩与其他产地的比较。对其活性的研究也可增加癌细胞的凋亡、迁移及作用通路，更加系统地阐述寒地黄芩与其他产地黄芩的区别。