lnc-SNHG5及miR-155在子痫前期患者血清及外泌体中的表达及其胎盘源性检测

许洪梅，张媛，章乐霞，周淑

子痫前期(preeclampsia，PE)是产科严重并发症之一，在孕妇中发病率约为4%～6%，也是导致产妇死亡的重要因素之一[1]。PE病情变化复杂，病因不明，目前研究认为该疾病为多种因素共同导致[2]。胎盘功能障碍是该疾病的主要表型，胎盘源性因素作用于全身系统，引发的一系列病理表现可能为PE发生的潜在机制。同时相关研究表明，多种非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)包括lncRNA、miRNA等在PE患者胎盘组织中差异性表达[3-4]，这些ncRNA能够通过交互调控，影响下游靶基因，在调节滋养细胞功能、子宫螺旋动脉重铸等过程中发挥作用，从而参与PE发病。然而，发生PE时胎盘-母体间的“对话”方式尚不明晰。

许晨等[5]研究发现miR-155在PE胎盘组织中表达增高，而我们的研究发现：在PE胎盘中低表达的lnc-SNHG5能够发挥竞争性内源性RNA样作用，并通过影响miR-155/特异性趋化因子受体4(chemokine receptor 4，CXCR4)途径，抑制滋养细胞侵袭，从而进一步明确了lnc-SNHG5与PE的相关性[6]。外泌体(exosomes，exo)中富含包括miRNA在内的多种成分，能够通过转运至效应器官/组织细胞，发挥诸多的生理调控作用[7]。因此，胎盘组织中差异性表达的lnc-SNHG5、miR-155能否以被外泌体装载的方式作用于PE患者全身，从而引发一系列的病理变化产生，值得探究。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2020年11月至2021年3月在乐山市人民医院产科住院接受剖宫产分娩的30例产妇；其中NC组15例，均为正常晚孕孕妇，无任何孕产期合并症，平均(25.45±6.17)岁，体质量指数(body mass index，BMI)≤25 kg/m2，平均孕周(38.85±3.01)周；PE组15例，均按照人卫第九版《妇产科学》标准诊断为PE，且未接受任何治疗，平均(27.67±4.17)岁，BMI≤25 kg/m2，平均孕周(36.38±2.71)周。两组患者均为单胎初产患者；既往无遗传性、传染性疾及代谢性疾病病史；无孕早期药物、放射线及毒物接触史。本研究经我院伦理委员同意并批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和材料

exoEasy Maxi Kit外泌体提取试剂盒(德国Qiagen公司)；exoRNeasy Serum(德国Qiagen公司)；PrimeScript RT reagent kit、SYBR Premix Extaq RT-PCR kit(日本Takara公司)；TRIzol(美国invitrogen公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国碧云天公司)；CD63多克隆抗体(中国武汉三鹰公司)；CD9单克隆抗体(英国Abcam公司)；PLAP单克隆抗体、HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；ECL底物液(北京普利莱基因技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 血清标本收集 入院后在接受药物及手术治疗前，分次采集、收集纳入孕妇晨起空腹肘静脉血共计15 mL。所有血浆样本均在采集后置促凝管中，4℃静置过夜后2 000 r/min离心5 min，吸取上层血清至EP管中，-80℃冰箱保存备用。

1.3.2 血清标本外泌体提取 使用0.8 μm的滤膜过滤两组血清，按照exoEasy Maxi Kit说明书步骤将过滤后血清与缓冲液1∶1混合，倒置混合均匀后加入至exoEasy自旋柱上，2 000 r/min离心1 min；收集离心液并加入缓冲液，5 000 r/min离心5 min；将旋转柱转移到新的收集管中，加入400 μL缓冲液孵育1 min，500 r/min离心5 min，磷酸盐缓冲液重悬离心沉淀，即得到两组exo(PE组exo、NC组exo)，留存备测。

1.3.3 血清标本exo鉴定 使用Nanosight NS300系统进行exoNTA鉴定，PBS缓冲液多次稀释exo样本，直至影像学判断样品于合适浓度下观察；依据收集的影像动态记录片段，分析测量exo样本颗粒粒径(nm)及对应颗粒浓度(颗粒个数/mL)。

使用2.5%的戊二醛4℃下固定两组外泌体，磷酸缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗3次(每次15 min)；随后使用2%锇酸溶液室温(20℃)下固定2 h；再次PBS液漂洗3次(每次15 min)；梯度乙醇脱水(20 min)；丙酮：812包埋剂(1∶1)混合液渗透过夜，纯812包埋剂渗透过夜；将包埋板于60℃下聚合48 h；切片(成片厚度60 nm～80 nm)；2%醋酸铀饱和水溶液及枸橼酸铅，各染色切片15 min后，室温干燥过夜；最后于透射电镜下拍照。

1.3.4 血清标本exo特征性蛋白及胎盘源性特异性蛋白检测 RIPA裂解液提取PE组exo、对照组exo总蛋白；检测蛋白浓度后，Western blot检测exo特征性蛋白：配胶后十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)；将目的条带电转至PVDF膜；用含5%脱脂奶粉的TBST室温摇床封闭2 h；PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜(抗体浓度：exo特征性蛋白CD9 1∶2 000、CD63 1∶400；胎盘源性特异性蛋白PLAP 1∶500)；TBST洗涤PVDF膜；PVDF膜浸泡于HRP标记二抗(1∶50 000)孵育液中，室温孵育2 h；ECL显影、定影，BandScan分析胶片灰度值。

1.3.5 血清标本及exo中lnc-SNHG5、miR-155在mRNA水平的表达检测 Trizol法及按照exoRNeasy Serum说明书步骤分别提取血清标本及exo中总RNA；检测RNA质量后，按照PrimeScript RT reagent kit、SYBR Premix Extaq RT-PCR kit说明书步骤进行实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)。引物序列详见表1。反应条件：95°C 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，40个循环。以U6为内参，进行PCR反应。每次检测设定3个复孔，每个样本重复3次。根据PCR扩增曲线，使用 2-△△Ct法计算各组中目的基因lnc-SNHG5、miR-155 mRNA水平的表达情况。

表1 目的基因引物序列

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 血清标本外泌体鉴定

NTA鉴定结果显示，PE组exo及NC组exo的粒径大小均主要集中于30 nm～200 nm范围内；粒子浓度分别为：为2.84×109particles/mL、 2.31×109particles/mL，见图1。

图1 NTA检测PE组exo及NC组exo粒径、浓度

于透射电镜下观察血清标本中所提取的PE组exo及NC组exo，可见两组形态均为典型囊泡状，圆盘双凹形；直径大小大多位于50 nm～150 nm范围内，见图2。

图2 PE组exo及NC组exo透射电镜图(比例尺200 nm)

2.2 血清标本外泌体特征性蛋白及胎盘源性特异性蛋白表达

Western blot结果显示，PE组exo及NC组exo均可表达exo表面特征性蛋白CD9、CD63以及胎盘源性特异性蛋白PLAP，见图3。

图3 Western blot检测PE组exo及NC组exo CD9、CD63、PLAP蛋白水平表达

2.3 血清标本及外泌体中lnc-SNHG5、miR-155在mRNA水平的表达情况

qRT-PCR结果显示，与NC组比较，PE组lnc-SNHG5 mRNA表达水平在血清及exo中均降低(P<0.05)；PE组miR-155 mRNA表达水平在血清及exo中均升高(P<0.05)，详见表4。

表4 血清及exo中lnc-SNHG5、miR-155在mRNA水平的表达

3 讨论

PE是以高血压、蛋白尿等多系统器官功能紊乱为主要表现的全身性疾病，是妊娠期导致孕产妇及胎儿不良结局的常见疾病[1]。胎盘娩出，PE症状即可缓解或消失[8]，提示胎盘功能异常在PE发病中的重要作用。有研究显示，妊娠状态下胎盘细胞分泌的微小脂质囊泡，即exo能够参与母体-胎盘间部分“对话”过程，从而起到传递及调节胎盘功能的作用[9]。因此提示，胎盘源性exo在PE发生发展过程中可能发挥重要作用。

exo直径仅为30 nm～100 nm，其存在于各种组织、体液、细胞中，并携带脂质组、蛋白质、核酸物质、非编码RNA[7]等成分，以发挥其病理及生理调节作用[10]。在exo所携带的各类分子成分中，miRNA能够发挥其对靶基因的定向调控作用，参与多种病理生理过程，已经在多个生命科学领域中得到了明确[11]。既往研究提示：在胎盘组织中病理性高表达的miR-155能够调控多个靶基因，参与滋养细胞凋亡、侵袭、血管生成以及炎症反应等多种生理过程，从而参与PE发病[12]；后续我们研究中进一步发现，lnc-SNHG5在胎盘组织中低表达，其能够负向调控miR-155，进而影响miR-155靶基因CXCR4的表达，从而抑制滋养细胞侵袭；提示lnc-SNHG5与miR-155之间构成的调节系统在PE发病中起到了一定作用[6]。但是，上述PE相关的差异性表达的非编码RNA(lnc-SNHG5、miR-155)是在胎盘组织中所发现，组织中的差异表达趋势，是否也同样存在于母体中？本研究中我们进一步检测了母体血清中lnc-SNHG5、miR-155的表达情况，结果提示：与对照组相比，PE组lnc-SNHG5 mRNA表达水平在血清中降低、miR-155 mRNA表达水平在血清升高；这与前期研究中，在胎盘组织中发现的lnc-SNHG5、miR-155差异表达趋势一致；进一步验证了lnc-SNHG5、miR-155与PE的相关性以及它们有成为疾病标志物的潜力。但是PE时，lnc-SNHG5、miR-155如何从胎盘作用于母体全身、以及这两者间如何完成调控作用尚未知。

结合exo具有细胞间基因交流的功能，本研究中，我们尝试分离PE及正常晚孕孕妇血清中的exo并鉴定这些exo是否具有胎盘源性。结果发现：PE组及对照组exo均可表达exo表面特征性蛋白CD9、CD63以及胎盘源性特异性蛋白PLAP。进一步检测exo中lnc-SNHG5、miR-155表达，结果提示：与对照组相比，PE组lnc-SNHG5表达水平降低、miR-155表达水平升高；这与我们前期在胎盘组织及血清中的检测结果均一致。与其他exo不同，胎盘来源exo可特异性表达PLAP[13]，通过上述研究我们验证了携带差异性表达lnc-SNHG5、miR-155的exo源自胎盘细胞，提示胎盘组织中差异表达的lnc-SNHG5、miR-155可能通过exo携带转运的方式实现了两者间调控，以及参与了PE发病过程。lncRNA虽不能直接调节蛋白质翻译过程，但是其可以通过miRNA实现其调节力，这一过程可能通过exo作为介导，在多种组织环境中实现；已有相关研究发现，exo源性miRNA能够通过参与调控多种细胞的生物学功能，影响螺旋动脉重铸、炎症反应、免疫调节、细胞代谢、自噬等过程[14-15]；并且相较于血清中，exo源性lncRNA、miRNA具有更好的稳定性并不易被降解[16-17]，从而完好无损地从其“发源地”前往“目的地”发挥相关作用。在后续的研究中，我们还将进一步通过细胞摄取实验验证携带差异表达lncRNA、miRNA的胎盘源性exo能否被滋养细胞、血管内皮细胞等直接摄取，流式细胞术联合侵袭小室、管样形成实验等并观察细胞功能是否发生变化，以及qRT-PCR、western-blot检测涉及的相关因子表达情况，以期从功能调节角度验证胎盘源性exo所发挥的具体作用。

综上，lnc-SNHG5、miR-155在PE患者胎盘组织、血清以及血清exo中具有一致的差异性表达趋势，并且血清中exo lnc-SNHG5、miR-155具有胎盘源性。上述发现有助于进一步明确lnc-SNHG5、miR-155与PE的相关性，并且为探索PE发病机制和PE的临床诊治提供新的思路以及潜在靶点。