子宫内膜异位症患者血清及子宫内膜组织miR-21水平与不孕不育的相关性分析

许文丽,邢秀月,徐川微

子宫内膜异位症主要患病人群是育龄期妇女，它是指子宫内膜组织在子宫内膜以外部位出现生长、浸润，可导致患者出现月经异常、痛经、性交痛、生育能力低、不孕等症状，能够对妇女的生育能力造成很大伤害，严重影响患者的生活质量[1-2]。目前子宫内膜异位症常用的检测方法为腹腔镜检查和病理学诊断，而腹腔镜检查因具有创伤性，使用时有很大限制[3]。微小RNA-21(miR-21)在胎盘及肿瘤等多种组织中高表达，在肿瘤微环境中参与肿瘤的发生发展[4- 5]。研究表明，miR-21在子宫内膜间质细胞增殖和转移中发挥重要作用[6]。推测miR-21可能与子宫内膜异位症的发生发展及患者不孕不育有关。因此，本研究通过探究血清及子宫内膜组织miR-21水平与子宫内膜异位症患者术后不孕不育的相关性，以期为改善不孕不育等不良结局提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至2020年11月于中南大学湘雅医学院附属海口医院就诊并行腹腔镜手术治疗的120例子宫内膜异位症患者为研究对象(患者均合并不孕症)，根据妊娠结局将其分为妊娠成功组69例(均为自然妊娠)与不孕不育组51例，其中妊娠成功组年龄23～34岁，平均(28.68±5.49)岁；不孕不育组年龄23～35岁，平均(28.72±5.68)岁。本试验经医院临床研究伦理委员会批准，符合伦理学标准。

纳入标准：① 所有患者均经病理证实，符合子宫内膜异位症的诊断标准[7]，子宫内膜异位症合并不孕症患者符合诊断标准[8]；② 夫妻有正常性生活且未采取任何避孕措施；③ 患者临床资料保存完整；④ 术前未接受过其他相关治疗者。排除标准：① 伴有其他妇科疾病及恶性肿瘤者；② 生殖器官发育不良者；③ 存在免疫功能异常及心、肝、肾等功能异常者。

收集并整理患者一般资料，主要包括年龄、体质量指数(body mass index，BMI)、基础卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、睾酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol，E2)、不孕年限等。

1.2 主要试剂与仪器

miRNA提取试剂盒(货号：AM1556)购自美国Life公司；TaqMan miRNA反转录试剂盒(货号：D1802)购自哈尔滨新海基因检测有限公司；miScript SYBR Green PCR Kit(货号：DXT-218073)购自美国Qiagen公司；Rox reference dye(货号：JKG029)购自上海经科化学科技有限公司。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)仪(型号：ABI 7700)购自美国Applied Biosystems公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集及保存 在腹腔镜手术时取得子宫内膜异位症患者的异位子宫内膜组织后，置于-80℃保存备用；采集子宫内膜异位症患者术后24 h血液样品，离心收集血清，置于-80℃保存备用。

1.3.2 血清及子宫内膜组织miR-21表达水平检测 采用miRNA提取试剂盒提取所有受试者血清及子宫内膜组织总RNA，反转录试剂盒将RNA反转录得cDNA。采用qRT-PCR仪对目的基因miR-21和内参U6进行扩增。反应条件：95℃ 10 min；95℃ 5 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。反应体系：cDNA模板(50 ng/μL)1 μL，miScript SYBR Green Mix(2×)5 μL，Rox reference dye(50×)0.2 μL，ddH2O 3.0 μL，上下游引物(10 μM)各0.4 μL，引物序列详见表1。各样品均重复3次，采用2-ΔΔCT法对各组血清及子宫内膜组织miR-21表达水平进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 子宫内膜异位症生育指数测评[9]子宫内膜异位症生育指数(endometriosis fertility index，EFI)评分内容主要包括手术因素和病史因素，手术因素包括美国生殖医学协会修订的(revised American Fertility Society，r-AFS)子宫内膜异位症分期总分(01分)以及最低功能评分(03分)，病史因素包括生育史、不孕年限、年龄(每项02分)。EFI总分10分，得分越高则妊娠概率越高。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 妊娠成功组与不孕不育组一般资料比较

妊娠成功组与不孕不育组年龄、BMI、基础FSH、LH、T、E2、不孕年限比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，详见表2。

表2 妊娠成功组与不孕不育组一般资料比较

2.2 妊娠成功组与不孕不育组血清及子宫内膜组织miR-21表达水平比较

不孕不育组血清及子宫内膜组织miR-21表达水平均高于妊娠成功组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见下页表3。

表3 妊娠成功组与不孕不育组血清及子宫内膜组织miR-21表达水平比较

2.3 血清及子宫内膜组织miR-21水平对子宫内膜异位症患者妊娠结局的预测价值

分别以血清、子宫内膜组织miR-21单个指标检测值及二者联合预测概率值为检验变量绘制ROC曲线，结果显示，血清、子宫内膜组织miR-21水平预测子宫内膜异位症患者不孕不育的曲线下面积(area under curve，AUC)分别为0.899(95%CI:0.846-0.951)、0.942(95%CI:0.901-0.983)，截断值分别为1.212、1.325，特异性分别为79.7%、92.8%，敏感度分别为82.4%、86.3%；二者联合预测的AUC为0.977(95%CI:0.955-0.998)，特异性为91.3%，敏感度为92.2%，见图1。

图1 血清及子宫内膜组织miR-21水平预测子宫内膜异位症患者妊娠结局的ROC曲线

2.4 子宫内膜异位症患者血清及子宫内膜组织miR-21表达水平与EFI评分的相关性

以ROC曲线结果中的截断值为界，将子宫内膜异位症患者血清miR-21分为高表达62例、低表达58例；子宫内膜组织miR-21分为高表达59例、低表达61例。Spearman法分析结果显示，子宫内膜异位症患者血清及子宫内膜组织miR-21表达水平与EFI评分均呈负相关(r=-0.483、-0.570，P<0.05)，详见下页表4。

表4 子宫内膜异位症患者血清及子宫内膜组织miR-21表达水平与EFI评分的相关性

2.5 影响子宫内膜异位症患者妊娠结局的多因素Logistic回归分析

将子宫内膜异位症患者是否术后不孕不育作为因变量，以血清miR-21、子宫内膜组织miR-21、年龄、BMI、基础FSH、LH、T、E2为自变量进行Logistic回归分析，结果显示子宫内膜组织miR-21是影响子宫内膜异位症患者术后不孕不育的独立危险因素(P<0.05)，详见下页表5。

表5 影响子宫内膜异位症患者妊娠结局的多因素Logistic回归分析

3 讨论

子宫内膜异位症的发生发展过程仍有待探究，发病机制有经血逆流、种植及体腔上皮化等，其某些生物学行为与恶性肿瘤相似，具有局部散播、远处转移、组织侵袭等恶性行为[10]。子宫内膜异位症根治手术有可能使妇女丧失生育能力，因此临床上对有生育需求的子宫内膜异位症患者一般采用保守性手术治疗[11]。子宫内膜异位症成为困扰医学界的难治之症，需从基础、临床等各方面加强病理研究，解决诊治难题。

miRNA是一类内源性的非编码单链RNA，可按照碱基互补配对原则与靶基因3’端非编码区结合，在转录后水平调控靶基因的翻译，下调靶蛋白的生成，进而在肿瘤发生、细胞代谢、胚胎发育等方面发挥重要调控功能[12]。miR-21参与细胞趋化运动及肿瘤细胞的侵袭、转移[13]。子宫内膜异位症的发生、发展与纤维化相关因子的异常表达密切相关，而miR-21参与多种纤维化疾病的调控[14- 15]；丁屹等[16]研究结果显示miR-21在子宫内膜异位症患者血清中高表达，且对子宫内膜间质细胞增殖和转移能力有一定影响，因此推测miR-21可能参与子宫内膜异位症的病情进展，进而影响患者预后。本研究结果显示子宫内膜异位症术后不孕不育患者血清及子宫内膜组织miR-21表达水平均高于妊娠成功患者，且子宫内膜组织miR-21是影响子宫内膜异位症患者术后不孕不育的独立危险因素。提示miR-21可能通过高表达参与子宫内膜异位症患者术后不孕不育的病理机制。Liu S等[17]研究显示，miR-21是参与子宫内膜异位症发病的细胞信号通路的重要调节因子。本研究推测术后病理状态下miR-21水平上调，通过相关靶基因对纤维化相关因子的表达进行调控，发挥致纤维化作用，进而造成患者盆腔粘连加重、卵巢功能损伤、盆腔内环境恶化，最终干扰精卵结合、造成受精失败。研究表明，EFI评分是一种用于预测子宫内膜异位症患者预后的工具，该评分综合考虑手术及患者病史等多方面因素，可有效预测患者术后妊娠率[18]。本研究结果显示，子宫内膜异位症患者血清及子宫内膜组织miR-21表达水平与EFI评分均呈负相关，且血清、子宫内膜组织miR-21对患者不孕不育均有一定的预测价值，其AUC分别为0.899、0.942。进一步提示临床中可考虑将miR-21作为评估子宫内膜异位症患者预后的标志物，有利于早期筛选术后不孕不育患者，对于高危患者应积极给予治疗措施，协助患者妊娠。

综上所述，子宫内膜异位症术后不孕不育患者血清及子宫内膜组织miR-21水平升高，且血清及子宫内膜组织miR-21表达水平与EFI评分均呈负相关，miR-21在子宫内膜异位症患者术后不孕不育的病理机制中发挥重要作用。miR-21检测简单易行，无操作性创伤，降低了医疗费用和患者负担，可能作为子宫内膜异位症患者术后不孕不育的预测指标和潜在治疗靶点。但miR-21在子宫内膜异位症及不孕不育病理机制中的作用极为复杂，需进一步深入分析。