腺苷酸活化蛋白激酶在奶牛疾病中的作用研究进展

窦文丽，宝 华，曹佩佩，孙奕烁，刘吉国，杨文飞，马 云，马燕芬，

（1.宁夏大学农学院/宁夏回族自治区反刍动物分子细胞育种重点实验室，宁夏 银川 750021；2.内蒙古自治区农牧业科学院动物营养与饲料研究所，内蒙古 呼和浩特 010031；3.宁夏新澳农牧有限公司，宁夏 灵武 750406）

随着奶牛业现代化养殖水平的不断提高，奶 牛代谢病和乳腺炎等疾病发病率显著提升， 严重制约着奶牛业的健康发展。 能量失调被认为是导致疾病发生的重要因素， 腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）在所有真核生物中高度保守， 是细胞能量稳态的关键调节因子［1］。 AMPK 的主要功能是检测ATP 水平的变化，当细胞能量状态下降时被激活，AMPK 激活后，通过磷酸化直接或间接调节下游因子， 促进分解代谢、抑制合成代谢，从而维持能量平衡。 AMPK 信号通路与多种功能如线粒体生物发生、细胞生长、氧化还原调节和细胞增殖［2］、细胞自噬［3］和炎症［4］等有关， 在肝脏、 骨骼肌、 心脏和中枢神经系统（central nervous system，CNS）等关键组织中发挥作用。 AMPK 在维持能量方面的核心作用使其成为预防和治疗代谢性疾病的一个重要治疗靶点，AMPK 的激活有助于提高炎症状态下的细胞存活率并减弱炎症反应［5-7］。 因此，阐明AMPK 在疾病中的调控作用机制对于降低奶牛生产期间的疾病发病率和提高乳品质起着关键作用。 该文综述了AMPK 在奶牛疾病中的调控作用， 以期为奶牛疾病的靶向治疗提供理论依据和技术支撑。

1 AMPK 概述

1.1 AMPK 结构

AMPK 是一种高度保守型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶， 作为细胞能量感受器对于机体能量稳态起到至关重要的作用［8］。AMPK 是一种异源三聚体复合物，由催化α 亚基、N 末端肉豆蔻酰化调节β亚基和核苷酸感应γ 亚基组成， 每个亚基都有多种亚型（α1、α2、β1、β2、γ1、γ2、γ3）组成，每个亚型由不同的基因编码组成［9］。 α 亚基包括丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（KD）、自身抑制结构域（AID）、β亚基相互作用的C 末端结构域（α-CTD）以及被称为α 连接子的腺嘌呤核苷酸传感器片段。 α 亚基的功能与AMPK 的活性有关，α-KD 的C 端小叶上有一个重要的Thr172 位点，是激活AMPK 活性所必需的位点， 最终直接影响AMPK 代谢途径相关基因的表达水平。 β 亚基在其C 端含有碳水化合物结合模块， 允许AMPK 与糖原结合，β-折叠参与结合α 和γ 亚基［10］，碳水化合物结合模块也可以作为一些AMPK 药理激活剂的结合位点，如A769662［11］。 此外，β 亚基还参与AMPK 向线粒体的募集和线粒体自噬的调节［12］，在AMPK 三聚体的形成和定位中发挥重要作用。 γ 亚基包含4 个进化保守的胱硫醚-β-合成酶（CBS）串联重复序列， 可以与AMPK 的3 种腺嘌呤核苷酸（AMP、ADP、ATP）竞争性结合，从而感知细胞能量状态［13］。

1.2 AMPK 激活

AMPK 监测细胞能量状态的能力由γ 亚基上的3 个可交换的腺嘌呤核苷酸结合位点提供。 当能量应激引起的AMP/ATP 和ADP/ATP 腺苷酸比率的增加会引起γ 亚基变构激活AMPK［14］。 同时，在葡萄糖缺乏、缺氧、缺血和高渗透环境等能量耗尽的条件下被激活［15］。 AMPK 通过减少体内ATP的消耗过程来维持能量平衡， 如合成脂肪基因和rRNA 的转运、核糖体蛋白的翻译、胆固醇和脂肪酸的合成；同时还可促进体内产生ATP 的分解代谢过程，如葡萄糖和脂肪转运、脂肪酸氧化、自噬、线粒体合成和氧化。 AMPK 活性受到多个上游激酶的相互影响，当机体能量水平较低时，γ 亚基发生变构，进一步促进AMPK 上游激酶对其磷酸化，从而调节细胞内重要的代谢途径［16-17］。 研究表明，AMPK 的 活 化 与 苏 氨 酸 172 （threonine172，Thr172） 的磷酸化相关，Thr172 的磷酸化产物至少由两个上游激酶肝激酶B1 （liver kinase B1，LKB1）［18］和 细 胞 内 钙 调 素 依 赖 性 蛋 白 激 酶β（CAMKKβ）［19］介 导， 可 能 仍 有 其 他 激 酶 激 活AMPK，但尚未确定［20］。 在炎症等特定条件下，转化生长因子β 活化激酶1 （TAK1） 也可能激活AMPK［21］。

2 AMPK 在奶牛疾病中的调控作用

2.1 奶牛乳腺炎

2.1.1 乳腺炎

乳腺炎是奶牛乳腺实质器官发生生物性或机械性损伤所导致的局部或全身炎症反应， 受感染的乳腺部位出现红色、发热和肿胀等临床特征。常引起奶牛产奶量下降、乳品质降低，严重的乳腺炎症会导致奶牛死亡， 是制约乳产业发展最常见且最为严重的生产性疾病之一。 来自环境中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌以及高精料日粮饲喂导致的瘤胃内产生的内源性脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 等均是诱导奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）产生炎症的主要因素。 由LPS 诱导的一系列炎症反应已被证明会导致细胞损伤和细胞凋亡， 诱导乳腺发生免疫反应和氧化损伤， 以释放促炎介质以及抗氧化相关的ROS 和NO 等因子［22］，核因子-κB（nuclear factor Kappa-B，NF-κB） 和核因子E2 相关因子2（nuclear erythroid factor 2-related factor 2，Nrf2）信号通路分别调节细胞对炎症和氧化应激的反应。NF-κB 和Nrf2 两者之间的相互作用对细胞的炎症、氧化应激和免疫反应产生影响，从而对维持细胞代谢和内部环境的稳定性发挥重要作用。

2.1.2 AMPK/NF-κB 信号通路

当LPS 被BMECs 上的Toll 样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）识别并结合后，从而激活下游信号通路诱发乳腺炎。在静息状态下，NF-κB 通常与IκB 结合存在于细胞质中， 当LPS 激活后IκB 和NF-κB p65 磷酸化， 转移入核内， 与特定的DNA序列结合并促进下游促炎因子的转录， 发挥促炎作用［23］。AMPΚ 是细胞能量稳态的关键调节剂，在免疫和抗炎方面也发挥作用。 活化后的AMPK 可通过调控下游的沉默信息调节相关酶1（sirtuin1，Sirt1） 和过氧化物酶体增殖物激活受体γ 共激活因 子 1α （peroxisome proliferator -activated receptorγcoactivator-1，PGC-1α） 直接或间接调节NF-κB 的活性， 从而抑制肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α） 和白细胞介素1β（interleukin 1，IL-1β）等炎症因子的表达并发挥抗炎作用［24］，但LPS 和TNF-α 的激活则会降低成纤维样滑膜细胞（fibroblast synovial cells，FLS）中AMPK的活性。 Sirt1 作为一种NAD+依赖性脱乙酰酶，在体内能量代谢和炎症反应中也发挥作用，AMPK的磷酸化反应会间接促进Sirt1 受体的表达，从而抑制NF-κB p65 的易位和活化，降低炎症反应［25］。此外，AMPK 通过直接磷酸化苏氨酸（threonine Thr117）和丝氨酸538（serine538，Ser538）的结合并激活PGC-1α 发挥抗炎作用，PGC-1α 是一种转录激活因子， 其转录活性在细胞中受到多种蛋白质翻译后修饰的调节，包括磷酸化、乙酰化和泛素化。在炎症期间，低水平的PGC-1α 会下调线粒体抗氧化基因表达水平，产生氧化应激，并促进NFκB 的活化，诱发炎症；而上调PGC-1α 表达则会抑制NF-κB p65 的磷酸化，从而缓解炎症［26］。

2.1.3 AMPK/Nrf2 信号通路

影响炎症反应且最终导致乳腺发生严重炎性反应的主要原因为氧化应激。 氧化应激是由LPS引发的免疫反应和活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成的结果，Nrf2 是细胞内极其重要的抗氧化相关转录因子，位于AMPK 的下游，可以保护细胞免受氧化应激和亲电应激［27］，抑制炎症介导的损伤，从而维持细胞内环境稳态。 研究发现，Nrf2发挥抗炎作用， 是通过激活AMPK 信号通路来实现的［28］。 众所周知，自噬是维持细胞稳态的重要过程，在真核细胞中高度保守，AMPK 作为Nrf-2上游的激酶，在调节Nrf-2 中具有重要作用。通常Nrf-2 以游离形式存在于细胞质中，当细胞受到炎症刺激或氧化还原失衡时， 上游AMPK 被激活， 进而促进游离Nrf-2 进入细胞核并激活下游相关基因的表达。有研究表明，薄荷醇可以通过激活AMPK/Nrf-2 信号轴自噬反应，从而发挥抗炎作用［29］。

2.2 奶牛酮病

2.2.1 酮病

围产期高产奶牛对代谢性疾病和环境应激非常敏感，由于奶牛干物质摄入不足，无法满足机体正常维持和产乳的需要， 极易产生能量负平衡（negative energy balance，NEB）， 泌乳早期NEB 的特点是肝脏糖异生无法为维持泌乳提供足够的葡萄糖［30］。 NEB 引起的代谢紊乱最终会发展成为亚临床酮病或临床酮病， 目前我国奶牛酮病发病率高达15%～30%［31-32］。 酮病发生期间奶牛产奶量和繁殖效率降低，真胃移位、跛行和子宫炎等发病风险增加［33-34］。 同时在生产中可通过测定β-羟基丁酸（beta hydroxybutyric acid，BHBA）含量来判定酮病的发病情况。奶牛酮病发生时，相关的能量代谢激素胰高血糖素 （glucagon，GLN） 和胰岛素（insulin，INS）发生了明显的变化，AMPK 作为能量感受器，其活性也随之发生变化，因此，找寻干预奶牛酮病发病的关键靶点至关重要。

2.2.2 GLN 与奶牛酮病

胰高血糖素（glucagon，GLN）可调节肝脏中的糖原分解和糖异生。 除肝脏外，GLN 在心脏、淋巴母细胞、脑、视网膜、胃肠道也出现高表达。在饥饿状态下，GLN 水平升高和INS 水平降低会减弱脂肪组织中的脂肪生成， 加重酮病奶牛的肝脏脂质代谢紊乱。

2.2.3 GLN 与AMPK 信号通路

AMPK 存在于肝脏、骨骼肌、心脏、下丘脑及脂肪组织，作为细胞能量感受器，AMPK 在调节糖酵解、葡萄糖转化、脂类代谢过程中发挥着重要作用。GLN 水平升高会导致肝脏能量消耗，从而增加AMP/ATP 的比例，增加AMPKα 亚基上Thr172 位点的磷酸化，从而使AMPK 的活化［35］。AMPK 信号通路在肝脏脂质代谢中起核心作用，AMPK 的缺失会增加血浆中甘油三酯（triglycerides，TG）含量促进肝脏脂肪生成。 AMPK 可通过调节转录因子固醇调节元件结合蛋白1c （sterol regulatory element binding protein 1c，SREBP-1c）和过氧化物酶增殖物激活受体-α（peroxidase proliferators activate receptors-α，PPARα） 等调节肝脏的脂质代谢。PPARα 作为一种配体激活的转录因子， 被AMPK激活后起到调节脂质氧化基因表达的作用， 有动物试验表明，PPARα 缺乏会导致脂肪酸氧化，脂质代谢发生紊乱，敲除PPARα 会加重小鼠肝脂肪变性和增加血液TG 浓度［36］。奶牛机体产生的高水平GLN 会通过激活AMPK/PPARα 通路促进脂肪酸氧化，酮病奶牛通常会表现出严重的NEB，导致肝脏脂肪组织内的TG 分解，释放大量的非酯化脂肪酸（non-esterified fatty acids，NEFA），脂肪酸的氧化可以产生更多的ATP 来缓解NEB。 SREBP-1c 通过转录调控脂肪生成基因来控制脂肪生成，SREBP-1c 过表达可增加小鼠脂肪酸合成速率［37］。酮病状态下，GLN 激活的AMPK 可通过抑制牛肝细胞中SREBP-1c 的表达和转录活性， 从而减少肝脏脂质的合成［38］。因此，GLN 可通过激活AMPK增强肝细胞中脂质氧化并抑制脂质合成， 从而产生更多的ATP 以改善酮病奶牛的肝脏脂质代谢紊乱。

2.2.4 INS 与酮病及AMPK 信号通路

胰岛素（insulin，INS）在酮病奶牛体内也发生显著变化。 INS 是由胰腺的β 细胞分泌，INS 可直接作用于肝脏或间接作用于脂肪组织、 胰腺和大脑来抑制肝脏糖异生和糖原分解， 进而抑制葡萄糖的生成［39］。 AMPK 作为一种细胞能量感受器，激活后会提高各种器官的INS 敏感性。 高水平的INS 会失活AMPK，从而抑制脂质氧化，促进脂质合成，造成脂质堆积［40］。 此外，研究发现β-氨基异丁酸（β-aminoiso-butyric acid，BAIBA）可通过激活AMPK 信号通路改善LPS 诱导的分化脂肪细胞中的促炎反应和INS 抵抗，BAIBA 还具有减轻采食高脂日粮（high-fat diet，HFD）诱导的小鼠炎症和胰岛素抵抗的功效［41］，因此，AMPK 在BAIBA对分化脂肪细胞炎症和胰岛素抵抗的有益作用中起着至关重要的作用。

2.3 奶牛脂肪肝

2.3.1 脂肪肝

围产期奶牛在NEB 状态下启动脂肪动员以满足机体的能量需求， 而脂肪动员则会产生大量的NEFA。 肝脏是脂肪酸代谢的主要部位，当血清中NEFA 浓度升高， 肝脏对NEFA 的摄取超过肝脏合成和分泌脂蛋白的能力时， 就会导致肝脏脂质积累，诱发脂肪肝。 NEFA 具有明显的脂毒性，会损伤线粒体功能，产生大量的ROS，肝细胞中的脂质积累会导致氧化应激和线粒体功能障碍增加，从而促进促炎细胞因子的分泌，继而发生炎性反应。脂肪肝发生时，血清中成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21）和总血红蛋白（hemoglobin，Hb）的浓度也会升高［42］。

2.3.2 AMPK 与脂质合成

肝脏是脂质合成的主要部位， 肝细胞主要负责肝脏的生理和代谢功能， 肝脏中的脂质水平在脂质合成和脂质氧化之间保持动态平衡， 肝脏中过多的脂质积累则会导致脂肪变性。 AMPK 是脂质稳态中最重要的调节因子之一［43］。SREBP-1c 作为脂质合成的关键转录因子， 参与编码脂肪生成中限速酶基因的转录激活［44］，正向调节脂肪酸合成酶的表达，SREBP-1c 的活性受AMPK 的负反馈调节。 激活AMPK 会直接磷酸化SREBP-1c 并抑制其核转位，间接调节脂肪基因的表达，从而抑制TG 的合成。 SREBP-1c 表达上调则会增加TG含量， 多酚类化合物如短叶苏木酚酸甲酯则具有激活AMPK，减弱肝脏脂质积累和降低TG 水平的功效［45］。

2.3.3 AMPK 与脂肪酸氧化

为了防止肝脏脂质沉积过多， 肝脏组织会产生β-氧化，将脂肪酸在一系列酶的催化下加速氧化生成二氧化碳和水，并释放能量，这是脂肪酸氧化的主要途径，也是体内脂肪酸代谢的主要过程，可以缓解脂肪肝的发生。 低水平的二酰甘油酰基转移酶（diacylglycerolacyl transferase，DGAT）可改变脂质稳态，导致脂肪酸氧化产生ROS，造成肝细胞氧化损伤［46］。 线粒体是脂肪酸β-氧化的主要活动场所， 进入线粒体的脂肪酸首先需要在肉毒碱棕榈酰基转移酶-lα（carnitine palmityl transferase-1α，CPT-1α）的催化下，与肉毒碱结合转运之后才能进入线粒体内部被氧化分解，CPT-1α 水平的高低在一定程度上反映肝脏内线粒体β-氧化的速率。 此外，过氧化物酶体是β-氧化的另一活动场所。 酰基辅酶A 氧化酶1（acyl-CoA oxidase 1，ACOX1） 被认为是过氧化物酶体β-氧化途径中的一种限速酶，可以促进脂肪酸的分解代谢，ACOX1缺陷的小鼠会表现出脂肪肝变性和脂肪性肝炎［47］。 AMPK 被证实作为β-氧化关键的蛋白［48］，参与肝脏内脂肪酸的分解代谢，AMPK 磷酸化后促进CPT-1α 和ACOX1 的表达增强脂肪酸的氧化，AMPK 去磷酸化会损害线粒体β-氧化， 在急性肾损伤模型中，AMPK 去磷酸化会破坏线粒体动态紊乱造成脂质堆积［49］。AMPK 还通过PGC-1α调控线粒体生物合成，从而间接调节β-氧化。 此外， 有研究证实FGF21 可介导牛肝细胞中AMPK信号传导促进β-氧化和转运， 减少脂质合成，从而减轻肝脏脂质的积累［50］。

2.4 乳脂和乳蛋白

BMECs 具有抵抗外界病原体入侵，合成和分泌乳汁的作用。 而乳汁的合成和分泌不仅是哺乳动物的典型特征， 也是生命周期中代谢需求最高的阶段之一。 乳脂和乳蛋白是乳汁中的重要固体成分， 主要由BMECs 中内质网状结构（endoplasmic reticular structure，ER） 及其附着的核糖体合成。乳脂和乳蛋白的合成是一个复杂的过程，在细胞内翻译和翻译后的多个水平上都受到特定基因的严格调控。

2.4.1 AMPK 与乳脂合成

乳腺上皮细胞通过平衡脂肪酸合成和脂肪酸氧化分解来控制乳脂水平。 目前的研究主要集中在从头合成脂肪酸（fatty acids，FA）的过程，包括脂肪酸的摄取、活化、细胞内转运、延伸和去饱和，以及三酰基甘油（triacylglycerol，TAG）的合成和脂滴的形成等［51］。 许多脂肪酸从头合成限速酶如乙酰辅酶A 羧化酶α （acetyl-CoA carboxylases alpha，ACACA）和SREBP-1c 已被确定为AMPK 的下游靶基因。ACACA 催化乙酰辅酶A 转化为丙二酰辅酶A 并启动脂肪酸从头合成［52］。 SREBP-1c 是脂质稳态的转录因子， 可调节奶牛乳脂合成［53］。PGC-1α 被认为是过氧化物酶增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferator activated receptor -γ，PPARγ）的转录共激活因子，它调节肝脏和骨骼肌中的脂肪酸β-氧化。有研究发现AMPK 不仅通过乳脂合成过程调节乳脂生成，还通过β-氧化过程调节乳脂生成［54］。 也就是说，AMPK 的激活抑制了参与脂肪酸从头合成的限速酶和转录调节因子，并降低了PGC-1α 的乙酰化过程， 从而加强了脂肪酸的氧化，调节乳腺上皮细胞中的乳脂合成。

2.4.2 AMPK 与乳蛋白合成

乳蛋白合成主要受基因转录和蛋白质翻译过程的调控， 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）是促进乳蛋白合成代谢过程的主要调节剂，在进化的过程中非常保守。雷帕霉素靶蛋白复合物1 （mechanistic target of rapamycin complex，mTORC1）的活性受到能量状态、细胞外生长因子和应激因子等各种信号调节。 核糖体蛋白S6 激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1） 和4E 结合 蛋白1 （P-4E binding protein 1，4EBP1） 是mTORC1 下 游 的 两 个 直 接 靶 点，mTORC1 通过调节这两个下游靶点来控制基因转录和蛋白质翻译，mTORC1 的激活进一步磷酸化核S6K1 和4EBP1 并促进蛋白质合成。 在大鼠［55］和 奶 牛［56］的 乳 腺 上 皮 细 胞 中，mTORC1 的 活 性 抑制可下调αS1-酪蛋白 （CSN1S1） 和β-酪蛋白（CSN2） 等乳蛋白基因的mRNA 表达及其蛋白质翻译［57］，而AMPK 的激活则可通过上调mTORC1信号传导和限速酶的表达来调节乳蛋白的合成。目前，AMPK 是如何通过mTORC1 非依赖性途径通路调节乳蛋白合成的仍属未知。

3 小结与展望

AMPK 作为细胞能量感受器在哺乳动物能量稳态的维持和调节中发挥着重要作用， 在奶牛发生炎症时能量代谢会发生明显变化， 激活AMPK发挥抗氧化和抗炎作用。 AMPK 对乳脂和乳蛋白的合成也具有调控作用。 深入解析AMPK 在奶牛乳腺炎、脂肪肝和酮病中的作用，有助于了解其发病机制，为奶牛疾病的诊断和治疗提供新靶点。