副猪嗜血杆菌病检测技术

黄 利，袁东波，曹省艳，尹念春

（1.四川省阆中市农业农村局，四川 阆中 637400；2.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；3.四川省绵阳市动物疫病预防控制中心，四川 绵阳 621000；4.四川省遂宁市动物疫病预防控制中心，四川 遂宁 629000）

副猪嗜血杆菌病又称多发性纤维素性浆膜炎和关节炎，由副猪嗜血杆菌（Hps）引起。

病猪主要症状为发热、咳嗽、呼吸困难、行动障碍等。该病2 周龄至4 月龄仔猪，特别是断奶期和保育期仔猪多发，发病率可高达40%，病死率达50%～90%，成年猪病死率稍低。该病多为慢性经过，致病菌易和猪链球菌、猪丹毒杆菌和猪放线杆菌等引起败血性细菌感染。

1 血清学检测

间接血凝试验（IHA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等基于抗体的血清学检测方法是常见及快速的副猪嗜血杆菌检测方法。

1.1 间接血凝试验（IHA）IHA 检测猪抗Hps，其原理是经酸处理后的红细胞易吸附Hps 抗原，在抗血清存在的环境下，与红细胞发生凝集。在建立间接血凝试验时，有研究者提取荚膜作为IHA 抗原，建立了较高特异性和敏感性的检测方法。有的将分离的3个型的菌体超声产物致敏后作为诊断抗原，建立了检测Hps抗体的IHA，其敏感性和特异性都优于琼脂扩散试验。

以Hps 7 型GS122 株灭活菌体为抗原，建立了微量凝集试验抗体检测方法。研究者利用猪瘟、猪链球菌病等9 种常见猪病阳性血清检测了该方法的特异性，利用4、5、12型检测了该方法的交叉反应，也进行了敏感性、重复性实验等，结果均较好。该方法加速了对副猪嗜血杆菌7型的疫苗免疫评价和流行病学调查的进度。

1.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）与间接血凝试验相比较，间接ELISA 方法敏感性更高、准确性更好和特异性更优。

选择合适的包被抗原是建立间接ELISA 检测方法的关键。以荚膜多糖和纯化蛋白作为包被抗原的间接ELISA 方法在临床诊断、免疫评价和流行病学调查中得到广泛运用。基于纯化的TbpA 蛋白作为包被抗原建立的Hps 抗体间接ELISA 检测方法，检测免疫抗体阳性率高，为免疫实时评价提供技术支撑。以Neu 作为包被抗原构建的间接ELISA 检测方法具有高特异性。基于黏附素蛋白的ELISA 检测方法能有效区分Hps 阴性血清和阳性血清，通过优化参数，研究了可应用于灭活疫苗免疫后的抗体监测和HPS的血清抗体检测。

2 病原学检查

2.1 细菌分离 副猪嗜血杆菌分离培养较为困难，采集经抗生素治疗后的病猪样品进行细菌分离培养难度更大。理想的Hps样本应来自既有该病特征性症状，又尚未使用抗生素治疗的急性发病猪。

2.2 免疫组化技术（IHC）由于各种细菌的交叉感染、继发感染，病猪临床上多表现为非特征性发病经过，这增加了临床诊断的难度。

组织学病变诊断解决了这一难题，利用福尔马林固定和石蜡包埋组织的免疫组化法可以敏感、直观的检测Hps 抗原，但运用此方法获得的抗副猪嗜血杆菌单克隆抗体非常少，限制了此法在临床诊断上的运用，因此其多用于研究发病机理。

3 分子生物学检测

3.1 聚合酶链式反应（PCR）有研究者建立了基于SYBR Green I 的快速检测Hps 的实时荧光定量PCR 方法，其敏感性比常规PCR 高，试验重复性好，同时对Hps具有良好的特异性，较大提高了临床诊断中低浓度样品检测的准确性。

研究者建立的基于PPV、PCV2、Hps 的三重实时定量荧光PCR，解决了临床中混合感染难以快速诊断的难题，也为三种疫病的免疫程序修订提供了依据。

3.2 肠杆菌科基因间重复序列PCR（ERICPCR）以肠杆菌科基因间重复序列（ERIC）为引物，可扩增未知细菌的基因序列，从而对具有菌株特异性的指纹图谱进行分析。

该技术在菌株特异性分析和描述上较血清学分型更准确。在流行病学调查中，对于场点间流行毒株的分析，此技术体现出了优势。

3.3 寡核苷酸特异性捕获圆盘杂交（OS-CPH）

代替细菌分离的技术还有寡核苷酸特异性捕获圆盘杂交（OS-CPH）试验，其敏感性可达到浓度低于100 CFU/mL的细菌，解决了临床诊断对低样品浓度的限制。该技术的时效性也优于细菌培养，可在24 h内得到结果。

在特异性方面，通过对15种猪体分离细菌所提取的DNA 样品的比较，均为阴性，此技术在确定发病猪场的流行情况中得到运用。

3.4 基因芯片检测技术 基因芯片技术在检测中的高通量、自动化等优势凸显。

有研究者建立了Hps和猪细小病毒基因芯片双重检测技术，该技术特异性、重复性均较好，固定的芯片4 ℃放置2个月后稳定性和重复性仍然很好，有效提高了临床诊断的时效性，也为基因芯片诊断技术的应用提供了前景。

3.5 纳米PCR检测方法 该方法基于纳米流体强大的热导性，控制PCR反应过程中的温度和时间，减少非特异性扩增，提高PCR 特异性产物。该技术在非洲猪瘟病毒检测上的运用证明，PCR反应效率得到有效提升，敏感性大幅提高，最低核酸检出量达到10个拷贝。

有研究者用建立的纳米PCR 检测Hps 与其他4种猪源细菌，以验证该纳米PCR的特异性，结果表明无非特异性扩增产物。该方法的敏感性比普通PCR 高10 倍，最低可检出4 个拷贝的Hps基因组DNA。因其较好的特异性和较高的灵敏度，该方法可为副猪嗜血杆菌病的防控和检验检疫提供技术支撑。

3.6 环介导等温扩增技术（LAMP）该技术利用Hps 的16S r RNA 序列设计引物，在酶的作用下进行环介导等温扩增出特异性的产物。

试验证明该方法敏感性比PCR 高，特异性良好，检测结果肉眼可见，实验操作简便，1 h 内能完成样品的检测，适用于基层进行现场快速诊断。

4 血清型与毒力因子测定

副猪嗜血杆菌的毒力在不同血清型之间存在变异，在同一血清型不同菌株之间也存在变异，这种毒力差异可能是由不同的基因表达方式所导致的。

据报道通过RT-PCR 技术对其离子转运蛋白相关基因（cirA）、溶血素相关基因（hhdBA）、抗菌素相关基因（copha）进行检测，发现具有毒力性的血清型中，约有一半多的血清型存在上述情况。