可降解水凝胶作为关节软骨修复材料的研究进展

吴晓芳，陈 凯，张德坤

(1 中国矿业大学 机电工程学院，江苏 徐州 221116;2 中国矿业大学 材料与物理学院，江苏 徐州 221116)

近年来因外伤、炎症或退变等导致的关节软骨损伤在临床上十分常见，并伴有关节疼痛、关节畸形、甚至关节功能障碍等明显症状，严重影响着病人的健康状况和生活质量[1-2]。由于关节软骨没有血管、淋巴管和神经支配，一旦发生磨损或创伤，很难恢复到原来的结构和状态。此外，软骨缺损和损伤可引起创伤后骨关节炎(OA)，增加了软骨损伤愈合的难度[3-5]。因此，关节软骨损伤修复一直是临床的重大难题之一。

传统治疗方法如微骨折、镶嵌成形术、自体软骨细胞移植和同种异体骨/软骨移植等可以减轻疼痛并改善关节功能，然而，这些方法产生的新生软骨通常构成I型胶原，缺乏Ⅱ型胶原的透明软骨特性，远期临床效果欠佳[6-8]。人工关节置换则存在假体磨损、腐蚀及松动等问题，且适用人群有限[9-12]。因此目前针对关节软骨损伤的修复方法都只是暂时缓解症状，而不是治愈，没有再生功能软骨。随着组织工程技术的发展，关节软骨的损伤修复进入了一个新高度[13-15]，该技术主要包括种子细胞、支架材料及细胞生长因子3个要素，其中支架材料用来模拟细胞外基质，为缺损部位细胞的生长、增殖和分化提供适宜的微环境，利用细胞和生物分子之间相互作用的天然生物过程促进关节软骨的修复再生[16-18]。因此，组织工程的成功很大程度上依赖于支架在结构和成分方面模仿相应组织的细胞外基质(ECM)的程度。

在所有的生物材料中，水凝胶因具有与细胞外基质相似的特性受到了广泛的关注，特别是作为软骨和骨组织工程的支架材料[19-21]。纵观近年来的研究，将可降解水凝胶用于关节软骨修复再生的研究主要集中在三个方面：一是利用可注射水凝胶进行原位修复，将具有生物降解性的可注射水凝胶包裹药物/细胞注入关节软骨缺损部位进行原位成型，这种微创手术造成的疤痕较小，可减少患者的疼痛[22-25]；二是通过传统方法制备组织工程支架进行植入修复，即采用模具浇铸、颗粒浸出、冷冻干燥、气体发泡等传统工艺制造三维多孔的组织工程支架，植入关节软骨缺损部位以模拟实际体内高度多孔且孔隙连通的微环境，为细胞或生长因子的结合提供合适的机械支撑和理化刺激[26-27]；三是直接3D打印关节软骨支架进行植入修复，即采用3D打印技术将生物材料、细胞和活性生物分子逐层沉积，制备用于软骨组织工程的功能仿生支架，从而实现缺损软骨的功能性再生和修复[28-30]。本文系统概述了近年来用于关节软骨修复再生的可注射水凝胶以及传统方法制造的三维多孔支架，重点归纳了3D打印的软骨支架和骨/软骨一体化支架在软骨组织工程领域的最新进展，并将多材料、多结构、多诱导的高仿生梯度支架作为未来软骨功能再生和修复的研究方向。

1 可注射水凝胶原位修复关节软骨

近年来，可注射水凝胶作为软骨修复的候选材料受到了广泛的关注。其宗旨是将负载有细胞或生长因子的水凝胶前驱液直接注入关节软骨的缺损部位进行原位填充，然后在短时间内快速聚合形成固体凝胶(图1)[31]。这种策略的优势在于可以通过微创手术很容易地填充不规则形状的缺损，不仅能够与缺损部位融合良好，而且细胞和生物活性因子可以均匀地结合在水凝胶中。

图1 可注射水凝胶用于关节软骨修复示意图[31]Fig.1 Schematic diagram of injectable hydrogel for articular cartilage repair[31]

1.1 可注射多糖类/蛋白类水凝胶

糖胺聚糖(GAG)和胶原蛋白是关节软骨的主要细胞外基质成分，其在支持软骨形成和调节软骨细胞表型的表达中发挥关键作用。为了在组成上模拟天然软骨组织，各种各样的多糖类生物材料和蛋白类生物材料已被用来制备可注射水凝胶，其中多糖类生物材料主要包括壳聚糖、海藻酸盐、透明质酸、肝素、硫酸软骨素等，蛋白类生物材料主要包括明胶(GT)、胶原蛋白、纤维蛋白、弹性蛋白等[32]。由于单一组分水凝胶材料在性能上往往存在不足，因此一些研究者将多糖类和蛋白类生物材料组合使用以改善可注射水凝胶的性能。例如，Hwang等[33]采用海藻酸盐颗粒和纤维蛋白基质开发了一种新的可注射混合水凝胶体系，将海藻酸盐颗粒引入到纤维蛋白基质中，增强了细胞的流动性和增殖、体积保持和血管化，从而使该混合水凝胶体系成为软骨组织工程应用的理想材料。Park和Lee[34]制备了一种可注射、可生物降解的氧化藻酸盐/透明质酸水凝胶，在小鼠体内注射含有原代软骨细胞的水凝胶后6周，可观察到有效的软骨再生。Balakrishnan等[35]在硼砂存在条件下通过自交联高碘酸盐、氧化藻酸盐和明胶生成了一种无需有毒交联剂、能够快速凝胶的可注射水凝胶。这种自附水凝胶与软骨组织结合良好，并能促进软骨细胞向基质内部迁移，是一种很有前途的可注射水凝胶材料。Kontturi等[36]将软骨细胞和转化生长因子(TGF-β1)封装到Ⅱ型胶原/透明质酸混合物中形成了一种可原位注射的力学性能良好而稳定的水凝胶，通过对体外培养7天期间细胞活力、增殖、形态、糖胺聚糖的产生和基因表达的研究，表明该复合水凝胶能维持软骨细胞的活性和特性。

1.2 可注射纳米复合水凝胶

为了进一步提高可注射水凝胶的机械强度和稳定性，一些研究者将微球粒子(如明胶[37]、海藻酸钠(SA)[38]、壳聚糖微球[39])、纳米颗粒(如羟基磷灰石[40]、金属粒子[41]、黏土[42])和纳米纤维(如白蛋白[43]、静电纺丝PCL[44]、二氧化硅纳米纤维[45])等填充剂加入作为可注射水凝胶材料用于关节软骨修复[46]。Liao等[47]开发了一种新型可注射三维海藻酸盐水凝胶，负载可生物降解的多孔聚(己内酯-乙二醇-己内酯)(PCEC)微球作为葡萄糖酸钙的容器，随着葡萄糖酸钙的释放，使得软骨细胞/海藻酸盐悬浮液和多孔微球转化为凝胶，可有效模仿细胞外基质的架构，结果表明，该复合水凝胶具有孔隙连通、压缩模量高、成型性好、降解性适中等优良特性，是一种适合软骨组织工程的基质。Fan等[48]通过乳液交联的方法制备了负载牛血清白蛋白(BSA)的壳聚糖微球(CMs)，并将其嵌入水溶性羧甲基壳聚糖(CMC)和氧化硫酸软骨素(OCS)的水凝胶中，生成复合CMs/凝胶支架。结果表明，植入CMs可以显著改善凝胶支架的力学性能和生物活性，且比未添加CMs的对照凝胶支架表现出更低的溶胀率和更慢的降解速度。Adedoyin等[49]利用功能性杂化无机氧化铁(Fe3O4)纳米粒子与聚异丙基丙烯酰胺(pNiPAAm)、可降解聚酰胺(PAMAMs)高分子共价结合得到了一种可注射纳米复合水凝胶，不仅缩短了凝胶化时间，而且具有响应控制特性。Eslahi等[50]提出一种基于矿物纳米黏土(laponite)、纤维蛋白(keratin)、三嵌段共聚物(pluronic)和壳聚糖生物聚合物的新型可注射热响应水凝胶用于关节软骨组织工程，加入6%(质量分数，下同)laponite 可使其黏弹性能提高6倍，同时观察到凝胶化温度降低，孔径显著减小，溶胀率和降解性也随之降低。Rampichová等[51]将可注射的胶原/透明质酸/纤维蛋白复合水凝胶与PCL纳米纤维混合开发了一种新型功能化水凝胶，观察到PCL纳米纤维的加入减缓了水凝胶的降解，提高了系统的稳定性，实现软骨修复所需的降解时间。这些研究表明加入合适的填充剂不仅会显著提高可注射水凝胶的力学性能，还会改变水凝胶的其他性能[52]，如凝胶时间/温度、可注射性、内部孔径、降解率、溶胀率和生物学性能，这主要得益于纳米微粒优异的理化性质(纳米微米级的外形尺寸、增大的比表面积和粗糙度)，增加了与聚合物链之间的物理或共价作用，提高了可注射水凝胶的机械强度和黏弹性能，同时由于纳米粒子的嵌入能有效改善水凝胶网络的结构特性和孔隙尺寸，因此能够在一定程度上增加细胞附着位点，进而刺激细胞生长和引导组织再生。

尽管可注射水凝胶具有类似天然ECM的理化性质，并具有良好的生物相容性，有助于促进软骨组织再生，但制备可注射水凝胶原位成型的化学交联方法却限制了它的广泛应用。可注射水凝胶的化学交联方法主要包括光聚合、酶交联、click化学反应、希夫碱反应、Michael加成反应等，其中光聚合通常需要一种光敏剂和长时间的照射，酶介导的水凝胶交联体系种类有限，click化学反应和希夫碱反应则需要有毒的交联剂(如戊二醛、碳二亚胺、genipin、己二酰二肼等)，Michael加成反应的凝胶化过程缓慢[53]。这些化学交联方法不仅会对体内造成一定的毒性，而且较长的交联时间不能满足临床应用所需的凝胶化速率，因此成为可注射水凝胶形成原位软骨支架发展的主要障碍。

2 传统工艺制造软骨组织工程支架

组织工程已成为修复软骨组织缺损的一种有前途的策略。一般来说，工程化组织由支架、细胞和必要的生长因子组成。理想的组织工程支架不仅要有良好的生物相容性和适宜的生物可降解性，还应具有贯通的多孔结构和适宜的孔隙率，以促进细胞的渗透和营养物质的交换。为了生产出具有理想孔径范围和孔径形态的工程支架来满足软骨组织再生的需求，各种支架制造技术已经被开发出来。目前传统的制造工艺主要包括颗粒浸出、气体发泡、热致相分离和冷冻干燥等[54]。

2.1 传统工艺的方法概述

颗粒浸出法已被广泛用于软骨组织工程制造多孔支架，它主要是将固体致孔剂(如氯化钠晶体、蔗糖晶体、明胶颗粒等)加入聚合物溶液中共混后倒入模具，待聚合物溶液固化后，通过诸如水或乙醇等溶剂的溶解滤掉致孔剂材料，从而形成一种多孔结构聚合物支架[55-57]。Kanimozhi等[58]为了改善壳聚糖和PVA聚合物的性能，采用盐浸法以NaCl晶体为致孔剂制备了多孔杂化支架。这种方法的主要优点是工艺简单，适用于多种聚合物材料，而且支架的孔径尺寸和孔隙率可以通过改变致孔剂颗粒的大小和数量进行调控。然而，这种方法制备的支架厚度较小，表面易形成致密的皮质层，影响支架的孔隙连通性。

气体发泡法是采用气体作为发泡剂，首先在高压下将CO2等气体施加于压铸或浇铸制备的固体盘状聚合物，待CO2饱和后降低压力，使溶解的CO2由于热力学不稳定性形成气体核生长，从而在聚合物基质中产生孔洞[59-60]。Nam等利用碳酸氢铵作为高效的气体发泡剂和颗粒致孔盐，制备了用于组织再生的高开孔可生物降解聚乳酸支架[59]。这种方法的主要优点是无须使用苛刻的化学溶剂，从而消除了制造过程的浸出步骤，减少了支架的制造时间。然而，通过气体形成的孔洞多数为封闭的孔结构，无法保证孔隙的连通性和控制孔径的大小。

热致相分离法是首先将聚合物溶解在高沸点、低挥发性的溶剂中形成均相溶液，然后放入模具中快速冷却直到溶剂冻结，使得体系形成以聚合物为连续相、溶剂为分散相的相分离结构，最后再选用适当的挥发性试剂把溶剂萃取出来，从而获得具有多孔结构的聚合物支架[61-63]。Sultana等[64]采用热诱导相分离技术制备了用于骨组织工程的三维多孔壳聚糖-羟基磷灰石复合支架。这种方法不需要额外的浸出步骤，但需要添加的有机溶剂(如甲醇、丙酮、环己烷等)可能会产生毒性，从而影响支架材料的细胞相容性。

冷冻干燥法的原理是利用冰的真空升华现象，即通过冷冻降温的方法使聚合物溶液中的水冻结成冰，然后在真空条件下使冰直接干燥升华变成气相，从而导致孔隙的形成[65-66]。这种方法制备的支架孔径和孔隙率在很大程度上取决于水与聚合物溶液的比例，而且通过改变冷冻温度可以调控支架的孔隙结构。Sultana等[67]将纳米羟基磷灰石(HA)粒子与聚羟基丁酸-共戊酸(PHBV)结合，采用冷冻干燥技术制备出具有相互连通多孔结构的HA/PHBV支架。这种方法的优点是既不需添加有毒的化学溶剂，也不需要额外的沥滤清洗步骤，但这种直接冷冻干燥方法制备的支架孔径较小，且冷冻干燥过程难以控制，会出现非均匀冻结现象。表1[55-57,59-63,65-66]列举出了几种传统工艺方法制造关节软骨组织工程支架的优缺点。

表1 传统工艺方法制造关节软骨组织工程支架的优缺点[55-57,59-63,65-66]Table 1 Advantages and disadvantages of traditional technologies for fabricating articular cartilage tissue engineering scaffolds[55-57,59-63,65-66]

2.2 多工艺结合制备软骨组织工程支架

基于各种传统工艺单一制造方法的局限性，研究者将两种或三种方法结合起来制造多孔组织工程支架[68]。Ribeiro等[69]结合颗粒浸出和冷冻干燥的方法将辣根过氧化物酶(HRP)介导交联的高浓度丝素水溶液(16%)制备成新型多孔的丝素蛋白支架，且具有较高的孔隙率(89.3±0.6)%和连通率(95.9±0.8)%。Xin等[70]将超临界CO2发泡与颗粒浸出方法相结合，采用三种不同尺度的NaCl颗粒(100～250 μm,<75 μm,<10 μm)分别作为致孔剂，制备出了具有大孔(100～300 μm)和微孔(<10 μm)双峰孔结构的PLGA支架，且随着NaCl质量分数的增加(60%～90%)，支架的孔隙率从(68.4±0.6)%提升到(88.7±0.4)%。Lei等[71]采用热致相分离和冷冻干燥结合的方法，将二氧化硅相在分子水平上均匀分布在明胶纳米纤维中，成功制备出纳米纤维明胶-硅杂化支架，并获得了优异的力学性能和生物性能。Yang等[72]采用热致相分离和颗粒浸出工艺相结合的方法，以蔗糖颗粒作为致孔剂制备出了孔径范围约为20～400 μm的多孔聚乳酸羟基乙酸(PLGA)支架。Salerno等[73]选用生物相容性和可生物降解性的明胶颗粒作为固体致孔剂，基于热致相分离、颗粒浸出和超临界CO2发泡相结合的方法，制造出具有大孔互联网络和纳米级纤维孔壁结构的PLA支架，该支架的总孔隙率高于95%，平均孔径为(171±62)～(440±60) μm。相比于两种工艺结合的制备方法，由三种工艺结合的制备方法比两种工艺结合的制备方法显著提高了软骨支架的孔隙率，这是由于三种工艺相结合能够更充分发挥各种工艺的优势，在最大程度上弥补单工艺方法带来的不足，从而制备出具有微米级大孔和纳米级小孔相互连通的多级网络结构。众所周知，较高的孔隙率和孔间连通性对组织工程支架来说至关重要，因为较高的孔隙率可以增加支架的比表面积，有利于细胞在支架上的大量黏附，而相互的孔间连通性则有利于水分和营养物质的运输，为细胞的代谢生长和增殖分化提供三维的微环境。由此分析可知，三种工艺相结合制备的多孔支架更接近理想的软骨组织工程支架。然而，尽管利用传统工艺相结合的方法能够制造出具有精确孔结构和高孔隙率的软骨支架，但在一定程度上还存在着内部孔洞分布不均的问题，因此距离理想情况下软骨组织工程支架的内部孔隙结构还有很大的挑战。

3 3D打印关节软骨组织工程支架

一个理想的关节软骨支架需要具备大量的结构特征来满足细胞增殖和营养物质扩散，如高孔隙率、足够的孔径和孔间连通性[74-77]。另外，还需要具有一定的力学特性来提供最初的机械稳定性和支持细胞活动的三维环境[78-80]。然而，传统的组织工程技术在制造支架时面临着诸多限制，包括精度和分辨率较低，无法控制几何形状和内部孔隙等。近年来,先进的3D生物打印技术的出现为软骨组织工程带来了革命性的变革，该技术能够通过简洁的程序打印出高精度、高效率、可定制的复杂结构。

3.1 单层均质同性软骨支架

3D生物打印技术的关键是生物墨水的选择，良好的生物墨水不仅应具有一定的力学性能以满足组织修复的要求，而且还应具有良好的生物相容性以支持细胞的黏附与增殖。因此，一些天然聚合物材料如明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、丝素蛋白、透明质酸、海藻酸盐和琼脂糖等由于其良好的生物相容性而被广泛用于3D打印关节软骨支架。例如，Xia等[81]在明胶和透明质酸混合墨水中加入甲基丙烯酸酐和光引发剂，通过光固化3D打印和冻干技术成功制备出具有精确外观形状、孔隙结构和良好降解率的多孔支架，并将该支架与软骨细胞结合，在体内外均成功再生出具有典型腔隙结构和软骨特异性细胞外基质的成熟软骨。Ni等[82]开发了一种由SF和羟丙基甲基纤维素(HPMC)组成的双网络(DN)水凝胶墨水，并负载骨髓间充质干细胞(BMSC)3D打印出双网络水凝胶支架，研究结果表明该支架可以保证组织工程中足够的营养供应和巨大的生化支持能力。Yang等[83]采用Ⅰ型胶原(COL)或琼脂糖(AG)与SA混合作为3D生物打印墨水。结果表明，与单独使用SA相比，SA/COL和SA/AG组的机械强度均有提高，且三种支架中SA/COL较其他两组更明显促进细胞黏附和增殖，增强软骨特异性基因的表达。Wu等[84]将纳米羟基磷灰石(n-HA)添加到SF和GT混合溶液中作为3D打印墨水，不仅提高了复合墨水的打印精度，且增强了SF/GT/n-HA复合支架的弹性模量。由于天然聚合物材料作为生物墨水具有较弱的力学性能，因此一些由合成聚合物材料组成的生物墨水也被应用到3D打印组织工程支架的领域，包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙醇酸(PLGA)、β-磷酸三钙(β-TCP)和羟基磷灰石(HA)等。例如，Jiao等[85]采用3D打印技术制备了HA-聚己内酯(PCL)支架，并探讨了其内部结构和力学性能，结果表明纳米HA/PCL支架具有相互连通且均匀分布的三维多孔结构，其抗拉强度和抗弯强度分别高达23.29 MPa和21.39 MPa。相比而言，这种由合成聚合物材料作为生物墨水3D打印的组织工程支架具有机械强度高的优点，在力学性能方面更接近于天然的原生组织。然而，尽管3D打印软骨支架在组织工程领域取得了重大的进展，但这些3D打印的软骨支架在组成和结构上都是单层均质同性的，不能实现原始软骨结构的理想再生，因为它们在重建天然软骨组织中各向异性组成和结构方面的能力有限。

3.2 三层梯度仿生软骨支架

考虑到天然关节软骨是由浅表层、中间层和深化层组成的特殊层次结构[86]，为了充分仿生天然软骨组织梯度的组成成分、机械强度和细胞分布，最近研究人员专注于对多层支架进行研究，以模拟天然软骨的复杂分层结构和理化特性。Klein等[87]提出区域特性打印构造的概念，即在逐层3D打印过程中，将几种类型的活细胞、生长因子和生物材料整合到不同层中，从而形成具有多层区域特性的组织工程结构，通过产生具有带状变化的软骨外基质来改善对软骨组织的修复，这为3D打印提供了一种重现天然软骨梯度特征的机制。Xu等[88]以聚乳酸-乙醇酸(PLGA)-细胞外基质作为生物墨水，采用3D打印技术制备了具有三层梯度结构的软骨支架，并通过定向冷冻技术构建了软骨支架的微观孔结构。结果表明所制备的支架具有仿生的、梯度的微结构取向和孔隙尺寸，对软骨修复具有重要意义。Zhou等[89]以不同比例的GelMA和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)作为打印墨水，采用立体光刻3D打印机制备出三层梯度支架，然后涂上赖氨酸功能化纳米管(RNTK)进行生物激发，结果表明三层梯度软骨支架GelMA-PEGDA-RNTK与对照组GelMA-PEGDA支架相比能更好地促进脂肪间充质干细胞的软骨分化。相比而言，这种三层梯度仿生软骨支架比单层均质同性软骨支架在软骨组织修复方面表现出了更优的效果。分析原因，主要是由于三层梯度软骨支架在结构上模仿了天然软骨从表层区、中间区到深化区这三层复杂的组织构造，这些梯度分层结构不仅有利于增加比表面积，促进细胞的黏附和增殖，而且有利于支架植入后与周围原生组织的整合，从而促进细胞在结构体和天然组织之间的迁移。因此，三层梯度软骨支架在未来的软骨修复和再生方面具有更大的应用前景。

3.3 双层骨/软骨一体化支架

一般情况下，轻度的软骨缺损只涉及两层以上软骨或全厚度软骨的损伤，但随着缺损程度的增加，会粘连延伸至下方的软骨下骨层，从而导致骨/软骨缺损。因此，迫切需要骨/软骨一体化支架以实现软骨和软骨下骨的同时修复和再生。Gong等[90]采用数字光处理技术(DLP)打印了载有白细胞介素(IL-4)的GelMA支架作为软骨层，并用熔融沉积成型技术(FDM)打印了多孔的聚己内酯和羟基磷灰石(PCL-HA)支架作为软骨下骨层，体内外实验表明，该支架的下层能促进成骨的分化和再生，上层负载的IL-4可缓解炎症，因此是一种既具有仿生性能又具有抗炎活性的双层支架。Gao等[91]开发了一种可生物降解的高强度超分子聚合物增强型水凝胶PACG(聚丙烯酰甘氨酸)，并与GelMA混合作为打印墨水，制备了上层含有Mn2+下层含有生物活性玻璃的双层支架，体内外实验表明，该支架能显著促进大鼠模型软骨和软骨下骨的同步再生。Gao等[92]将活性生长因子TGF-β1加入到PNT水凝胶(NAGA/THMMA共聚物)中诱导软骨分化，并将β-TCP纳米颗粒加载到PNT水凝胶中增强与宿主骨的生物活性结合，通过3D打印制备出一种双层骨/软骨一体化支架，结果表明β-TCP的引入不仅改善了支架的理化性质，而且促进了hBMSCs的增殖、ALP活性和分化。同时，添加TGF-β1可以促进hBMSCs的生长和软骨分化。另外，Wang等[93]也将转化生长因子TGF-β1加入Collagen Ⅰ中作为软骨层的打印墨水，并以成骨肽/磷酸三钙/聚乳酸羟基乙酸(Peptide/TCP/PLGA)复合材料作为软骨下骨的打印墨水，采用低温3D打印技术制备了双层骨/软骨支架，结果表明该支架具有非均匀的微观结构和梯度的力学性能，为大鼠骨髓间充质干细胞的组装和分化提供了一个良好的平台。尽管这些双层支架对骨/软骨缺损具有一定的修复效果，但仍不能将受损组织恢复到正常状态，因此，构建三维仿生的骨/软骨支架实现软骨与软骨下骨的同时修复和再生仍具有很大的挑战性。

3.4 三层骨/软骨一体化支架

为了充分了解骨/软骨缺损的再生策略，有必要了解天然关节软骨的组织结构和理化性质。事实上，成熟的关节软骨除了空间分布的软骨区和下骨区，中间还存在一层异质性的钙化软骨作为两者的过渡区。为了模拟骨/软骨组织的复杂分层结构，多层多相支架可能是同步软骨形成和成骨的可行方法。因此，人们对多层骨/软骨一体化支架的设计与构建进行了大量的研究。Zhu等[94]采用多喷嘴3D打印技术构建了一种三层梯度骨/软骨支架。三层支架均使用SA作为主要成分，对于中间钙化层和软骨下骨层，引入介孔生物活性玻璃(MBG)与SA形成复合材料，结果表明所有层中相同的SA组成通过额外的Ca2+交联整合在一起，提高了各层间界面的结合强度，且MBG的添加改善了整个骨/软骨支架的机械强度。Liu等[95]将不同比例的n-HA引入到GelMA中进行多喷嘴3D打印，制备了一种包含软骨层(15%GelMA)、中间界面层(20%GelMA+3%n-HA)和软骨下骨层(30%GelMA+3%n-HA)的三层梯度支架。体内外实验表明，使用三层支架与周围组织的融合更好，可以观察到更多软骨特异性细胞外基质和Ⅱ型胶原的沉积。Zhang等[96]基于钙化软骨或软骨下骨中n-HA含量很高(>65%)的理念，使用SA和聚丙烯酰胺(PAM)作为3D打印墨水的基础材料，设计并制备了一种三层梯度骨/软骨一体化支架，其中包含上层软骨层(SA-PAM)、中间钙化层(SA-PAM-40%n-HA)和软骨下骨层(SA-PAM-70%n-HA)。结果表明这种梯度结构能够提供良好的机械支撑，并在体内植入12周后呈现出良好的修复效果。相比来说，三层骨/软骨一体化支架比双层骨/软骨一体化支架在结构上更接近于天然关节骨/软骨组织，其包含的软骨层、钙化层和下骨层具有梯度的力学性能，能够承受人类关节从软骨到下骨快速变化的高负荷要求。此外，三层骨/软骨一体化支架中每个支架层的孔隙结构、成分组成及理化特性均可根据天然骨/软骨组织的属性进行仿生调整，从而达到与周围组织的更好融合。这不仅有利于细胞在工程支架与原生组织之间的自由迁移，而且有利于每层支架中的细胞进行区域特异性生长、增殖和分化，最终实现缺损关节软骨结构的理想再生。

综合以上研究现状，目前通过3D打印制备的骨/软骨组织工程支架主要分为两大类：纯软骨支架和骨/软骨一体化支架(图2)。其中，纯软骨组织工程支架的发展经历了从单层均质同性到三层梯度的巨大跨越，在宏观层次上更加接近于天然关节软骨的组织构造，但在微观层面，天然软骨组织各层的定向异性结构特征仍需进一步仿生构建，因此未来对纯软骨组织工程支架的研究重点应集中于三层定向异构的仿生软骨支架。对于骨/软骨一体化支架，由于钙化层的引入能够将关节软骨层与软骨下骨层牢固结合，从而实现了从双层支架到三层支架的重大突破，这对深度缺损的骨/软骨组织修复具有重要意义。为了进一步模拟构建体内的刺激环境，需要在支架内添加生长因子进行生物诱导，并施加一定的力学刺激进行机械诱导，从而赋予支架结构生物活性，促使支架结构功能化。

图2 目前3D打印软骨/软骨组织工程支架的研究现状及未来研究方向Fig.2 Current research status and future research directions of 3D printed bone/cartilage tissue engineering scaffolds

4 结束语

可注射水凝胶因其最小的侵入性和匹配不规则缺陷的能力，成为关节软骨修复再生的潜在工具。由于纯可注射水凝胶不能满足较高的力学要求，研究人员将纳米填料掺入水凝胶构建出可注射纳米复合水凝胶，以改善其力学性能，使之能与天然软骨组织相匹配。虽然可注射水凝胶在软骨组织工程领域取得了较大的进展，但可注射水凝胶往往缺乏宏观孔隙和复杂的微血管系统，从而导致种子细胞因缺乏营养物质和信号分子的运输而丧失相当大的活力和功能。传统工艺方法制造的组织工程支架克服了可注射水凝胶缺乏宏观孔隙的局限，通过颗粒浸出、冷冻干燥、气体发泡和热致相分离等多种技术结合，构建出了具有高孔隙率和适宜孔径大小的三维多孔支架，但这种支架的内部孔洞多数为封闭的孔结构，无法保证孔隙的连通性，这不利于营养物质、代谢产物和氧气的扩散以及细胞的浸润、迁移和组织的生长。

与传统工艺方法相比，3D打印技术的出现为软骨组织工程带来了里程碑的发展。基于3D打印技术能够逐层打印、精准调控的优点，生物3D打印的骨/软骨组织工程支架实现了从单层到多层的推进，以及从纯软骨到骨/软骨一体化的跨越，既模拟了天然软骨组织的多相材料，又模仿了天然骨/软骨组织复杂的层次结构。而且TGF，IGF，BMP等活性因子也逐渐被研究者加入3D打印墨水中进行生物刺激，从而诱导支架中不同分层的细胞实现区域特异性分化和生长，以达到最佳的关节软骨修复效果。然而，天然关节软骨组织在结构上的复杂性不仅体现在宏观的梯度分层结构，还需满足各分层中微观的定向结构，因此，有必要进一步研究制备梯度分层、定向异构的多尺度关节软骨支架。另外，天然关节软骨组织的细胞外基质环境是一个非常复杂的微环境，既有生长因子等化学刺激，又有一定的机械力学刺激，因此，需要构建模拟体内的刺激环境，赋予支架结构生物活性，促使支架结构功能化。总之，开展多材料、多尺度、多诱导的高仿生梯度支架是未来关节软骨组织工程的一个重要研究方向，这对关节软骨的修复再生治疗以及支架向临床转化具有重要意义。