氨氮胁迫对刺参“鲁海1号”非特异性免疫的影响

赵 斌，周红学，李成林，赵洪友，胡 炜，程晓艳，韩 莎

(1 山东省海洋科学研究院，山东 青岛 266104;2 山东省农业农村厅，山东 济南 250013;3 莱阳市海洋渔业有限公司，山东 烟台 265200;4 莱阳市渔业技术推广站，山东 烟台 265200)

刺参(Apostichopusjaponicas)是具有独特养生保健和生态环保作用的高价值海水养殖品种。我国的刺参养殖区域主要集中在山东、辽宁等省份的沿海地区[1]。为解决刺参养殖群体长期累代自繁、性状退化、成活率低、抗逆性差、生长缓慢等问题，基于当前经济棘皮动物育种方向，在以产量高、生长快为目标的基础上，将品质、抗逆性状逐步纳入选育目标[2]。山东省海洋生物研究院采用群体内累代选育技术，以生长速度快、成活率高为主要目标性状，经过连续4代选育，获得速生特征明显、成活率高、抗逆性强、性状稳定的刺参新品种“鲁海1号”(GS-01-011-2018)[3]，为刺参良种产业化发展提供了种质基础。

氨氮是养殖水体中常见的污染胁迫因子之一，研究发现，氨氮胁迫会导致水生生物摄食率降低、生长缓慢、组织器官病变、免疫系统功能受抑，最终致水生生物死亡[4-7]。目前，池塘养殖是刺参主要养殖模式之一[8]，在池塘养殖中，水中残饵、排泄物积累和氨化分解，以及长期不清塘、池塘老化等问题会提高水体中的氨氮浓度，导致刺参长期处于氨氮胁迫的生长环境中[9-10]。良种性状评估是科学、客观评价选育优势性状的基础手段[11]，探明良种适宜的培育条件对其大规模推广养殖，充分发挥良种贡献率有重要意义。本研究以刺参“鲁海1号”为材料，对其在氨氮胁迫下的存活率、特定生长率及非特异性免疫指标进行了分析，探明其对环境中氨氮因子变动的适应性，进而确定其对氨氮胁迫的耐受上限，旨在为该新品种在不同养殖水环境条件下的推广及探明其健康养殖免疫机制提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验刺参为好当家集团有限公司刺参“鲁海1号”新品种培育车间培育的大规格苗种，按体质量大小分为A组((30.2±0.2) g/头)和B组((59.2±0.8) g/头)，分别暂养于0.5 m3的圆形玻璃钢水槽中，暂养密度A组为240～320 头/m3，B组为120～200 头/m3，养殖用水为经沉淀沙滤的自然海水，盐度31±0.2，水温(15±1.5) ℃，pH 8.1±0.2，氨氮质量浓度低于0.05 mg/L。暂养期间每日换水1次，连续充气，每天投喂配合饲料1次。暂养适应7 d后，选取表观、摄食正常的健康个体进行试验。

1.2 试验设计

对暂养的不同规格刺参进行急性氨氮胁迫预试验，根据质量浓度与死亡率关系得出急性氨氮胁迫96 h的半致死质量浓度平均值为104.3 mg/L。以半致死质量浓度的10%作为本试验慢性胁迫氨氮浓度设置的依据[12]，设计不同处理进行试验。向自然海水中分别添加2，4，6，8和10 mg/L的NH4Cl，设置5个氨氮质量浓度组(A、B组分别记为A2、A4、A6、A8、A10和B2、B4、B6、B8、B10组)，参照Bower等[13]的方法计算可得各试验组非离子氨质量浓度分别为0.066，0.131，0.197，0.263和0.328 mg/L。同时，以氨氮质量浓度低于0.05 mg/L的自然海水为对照组，氨氮质量浓度记为0 mg/L(A、B组分别记为A0、B0组)。各试验组与对照组刺参均为20 头，于整理箱(80 cm×60 cm×48 cm)中培养，每试验组设3组平行。养殖条件和日常管理同暂养期，每天换水后用奈氏试剂法测定水中氨氮质量浓度并及时校正，氨氮质量浓度波动<0.1 mg/L，试验共进行15 d。

1.3 样品采集及指标测定

1.3.1 刺参存活率、生长指标 统计试验开始时刺参数量、取样数量及结束时存活数量，计算刺参存活率。试验开始时，将每个试验组内刺参取出称湿体质量(初始体质量(W0)；试验结束后，取刺参称湿体质量(终末体质量(Wt)。称量时，待刺参吐水后用吸水纸吸干体表水分，尽量避免体表水分所引起的称量误差。按以下公式计算刺参特定生长率(spectific growth rate，SGR)[14]：SGR =100×(lnWt-lnW0)/t。式中：t为试验持续的时间(d)。

1.3.2 刺参免疫指标 在试验第0(试验开始当天)，5，10和15 天分别对各组刺参进行取样，将样本置于灭菌玻璃培养皿中，在刺参腹部切1 cm长的切口，用灭菌枪头收集刺参体腔液，同组内刺参体腔液混匀后，于4 ℃、1 000 r/min离心10 min，取上清液，分装后保存在-80 ℃冰箱内待测。

采用黄嘌呤氧化酶法测定体腔液中的超氧化物歧化酶(SOD)活性，以1 mL体腔上清液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个活力单位；采用钼酸铵法测定过氧化氢酶(CAT)活性，以1 mL体腔上清液每秒分解1 μmol H2O2的量为1个活力单位；采用磷酸苯二钠法测定酸性磷酸酶(ACP)活性，以100 mL体腔上清液在37 ℃与基质作用30 min产生1 mg酚为1个活力单位；采用磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶(AKP)活性，以100 mL体腔上清液在37 ℃与基质作用30 min产生1 mg酚为1个金氏单位(king unit)。

1.4 数据统计

试验数据利用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比较。

2 结果与分析

2.1 氨氮胁迫对刺参“鲁海1号”存活、生长的影响

由表1可知，A0、A2、A4、A6 和B0、B2、B4、B6 组刺参存活率均为100.0%，A8、A10和B8、B10组刺参存活率均下降，其中A10组刺参存活率最低，为87.2%。A0、A2、A4和B0、B2、B4组刺参均可正常活动、摄食、生长，未表现出异常状况；A6和B6组刺参活动与摄食未见异常，生长不明显；A8和B8组刺参在10 d后出现不同程度的活动减弱、摄食量下降、生长停滞，其中B8组刺参在试验结束时出现体质量负增长；A10和B10组刺参均出现排脏、化皮和死亡个体。随着氨氮质量浓度的增大，试验组刺参的终末体质量和特定生长率均下降。A2、A4和B2组刺参终末体质量与对照组之间无显著差异(P>0.05)，其余试验组终末体质量均显著低于对照组(P<0.05)；2种规格刺参终末体质量最低值均出现在10 mg/L氨氮处理组，分别为25.83和54.71 g/头。A2组刺参特定生长率为0.708%/d，与对照组无显著差异(P>0.05)，其余试验组特定生长率随氨氮质量浓度增大而显著下降(P<0.05)；特定生长率最低值出现在A10试验组，为-1.165%/d。

表1 氨氮胁迫对刺参“鲁海1号”存活和生长的影响Table 1 Survival rate and growth of sea cucumber Luhai No.1 at different ammonia nitrogen concentrations

2.2 氨氮胁迫对刺参“鲁海1号”酶活性的影响

2.2.1 SOD活性 由图1可知，氨氮胁迫5 d时，A2、A4、A6、A8和A10组刺参体腔液SOD活性均显著高于对照组(P<0.05) ，SOD活性峰值出现在A4试验组，为58.6 U/mL；B组SOD活性均升高，其中B6和B10组显著高于对照组 (P<0.05)。氨氮胁迫10 d时，A2、A4、A6组刺参体腔液SOD活性显著高于对照组(P<0.05)，A8和A10组与对照组差异不显著(P>0.05)；B组SOD活性随着氨氮质量浓度的增加呈先增高后降低的趋势，其中B4和B6组显著高于对照组(P<0.05)。氨氮胁迫15 d时，与10 d相比各试验组SOD活性均下降，其中A8、A10和B10组均显著低于对照组(P<0.05)，其中以A10组SOD活性最低，为23.1 U/mL。

2.2.2 CAT活性 由图2可知，氨氮胁迫5 d时， A4、A6、A8和B2、B4、B6组的CAT活性均显著高于对照组(P<0.05)，A4组的最高为4.86 U/mL，显著高于其他组(P<0.05)。氨氮胁迫10 d时，A4、A8和B2、B4组的CAT活性均显著高于对照组，而A10和B10组均显著低于对照组(P<0.05)。氨氮胁迫15 d时，各试验组CAT活性均随氨氮质量浓度的升高总体呈降低趋势，A6、A8、A10和B6、B8、B10组均显著低于对照组(P<0.05)，其中以A10组CAT活性最低，为0.97 U/mL。

2.2.3 ACP活性 由图3可知，氨氮胁迫5 d时，A4、B4组刺参ACP活性均显著高于对照组(P<0.05)。氨氮胁迫10 d时，A2、A4和B4组的ACP活性均显著高于对照组(P<0.05)，A10、B10组均显著低于对照组(P<0.05)。氨氮胁迫15 d时，A8、A10和B10组的ACP活性均显著低于对照组(P<0.05)，B2组显著高于对照，其余各组与对照组无显著差异(P>0.05)。

2.2.4 AKP活性 由图4可知，氨氮胁迫5 d时，各试验组刺参AKP活性均有所上升，其中A8、A10和B2、B4、B6、B8组的AKP活性均显著高于对照组(P<0.05)。氨氮胁迫10 d时，A2、B2组AKP活性均显著高于对照组，其他各组与对照组无显著差异(P>0.05)。氨氮胁迫15 d时，与10 d相比各组AKP活性总体上均呈明显下降趋势，其中A10和B6、B8、B10组均显著低于对照组(P<0.05)，以B10组AKP活性最低。

3 讨 论

3.1 刺参在氨氮胁迫下的存活与生长情况

研究发现不同规格刺参对氨氮的耐受能力不同[21]。在本试验中，当氨氮质量浓度为6，8和10 mg/L时，胁迫作用较为明显，2种规格刺参“鲁海1号”的存活率与特定生长率存在一定差异。在存活率方面，相同氨氮质量浓度下2种规格刺参存活率差异未达显著水平(P>0.05)，表明在氨氮胁迫对刺参造成的生存压力上，没有体质量规格上的差别。在特定生长率方面，当氨氮质量浓度为6 mg/L时，经15 d慢性胁迫，小规格刺参体质量SGR为正值，大规格刺参SGR为负值，试验刺参处于生长停滞状态；当氨氮质量浓度为10 mg/L时，大规格刺参的负生长程度显著低于小规格刺参，表明当氨氮胁迫超过极限时，体质量规格较大的选育刺参可表现出更强的耐受能力与抗逆性。

3.2 氨氮胁迫对刺参“鲁海1号”免疫指标的影响

以往研究认为，水产养殖动物氨氮中毒致死可能与机体氧化损伤和免疫抑制有关[22-23]。水产动物机体免疫系统分为特异性免疫和非特异性免疫两类，鱼类、虾类、贝类和棘皮类动物的非特异性免疫在应对逆环境应激中起主导作用，非特异性免疫主要由细胞免疫和体液免疫组成，其中包括SOD、CAT、ACP等各种免疫酶类[24]。本研究发现，氨氮胁迫对刺参“鲁海1号”非特异性免疫指标影响显著，且与其生理活动、存活与生长存在一定关联性，随着胁迫时间的延长，不同氨氮质量浓度下刺参SOD、CAT、ACP和AKP活性均发生了明显变化。在非特异性免疫酶中，SOD和CAT是机体发生氧化代谢的酶类，二者协同作用，使自由基的产生和清除达动态平衡，减少机体氧化损伤，是机体内重要的保护酶系统[25-27]。在本研究中，试验第5天时，所有试验组SOD活性均上升，其中大规格刺参的2，4和8 mg/L氨氮处理组与对照组无显著差异，其余各组SOD活性均显著提高(P<0.05)。所有试验组SOD和CAT活性峰值基本均出现在第5天，其原因可能是适宜质量浓度的氨氮可减轻活性氧对刺参机体造成的损伤，促进刺参的免疫水平，这与刘洪展等[24]的研究结论相似。ACP和AKP能够杀死外来入侵的病原体，并能通过修改病原表面分子来加速吞噬细胞的吞噬以及异物的降解速度[28]。本研究中，试验组刺参ACP和AKP活性的消长不如SOD和CAT变化剧烈，整体也呈现先上升后下降趋势，说明ACP和AKP的应答随着氨氮胁迫时间的延长而变化。研究指出，长时间的氨氮胁迫会使动物机体免疫功能降低甚至低于正常水平[29-30]。在本研究结束时，氨氮胁迫较强的各试验组ACP和AKP活性均降到了较低水平，推测其非特异免疫调节已达到极限，降低了受其关联的各项生理功能，导致机体不能维持正常的生理状态。

朱江艳等[31]研究得出，氨氮胁迫对不同规格刺参非特异性免疫酶活性影响存在差异，但差异未达显著水平。本试验中，在相同质量浓度氨氮胁迫下，不同规格刺参体腔液中不同非特异性免疫酶活性的变化趋势随着胁迫时间的推移存在一定差异。整体上，体质量规格较小的刺参个体酶活性变化幅度相对大规格刺参更大，其原因可能是在自然环境中，规格较小的个体与大规格个体相比通常面临更大的生存压力，在面对胁迫环境时的响应速度更为迅捷，从而在氨氮胁迫时的非特异性免疫酶活性调节更为敏感。

近年来，因异常气候和极端天气增多，外界环境条件对刺参池塘养殖的影响加大，复杂的水环境往往导致氨氮含量处在较高水平，扰乱刺参正常生理状态，最终导致养殖刺参发生应激进而出现病害甚至死亡。根据本研究结果，在刺参“鲁海1号”养殖过程中，为有效提升新品种的良种贡献率，尤其应注意保持环境理化因子指标的适宜[32]。综合比较试验结果，认为养殖过程中应通过水质调控、底质改良等手段尽量降低水环境中的氨氮质量浓度，如遇突发情况应严格控制氨氮质量浓度在6 mg/L以下，而对于氨氮质量浓度高于8 mg/L的时间最好控制在不超过5 d，以降低过度应激对刺参造成的不良影响及患病和死亡的风险。