β-伴大豆球蛋白对IPEC-J2细胞损伤的作用机制研究

孙智峰，王 蕾，刘羽佳，丁红研，王 志，李思婷，王承智，李 玉，王希春，吴金节

(安徽农业大学 动物科技学院,安徽 合肥 230036)

大豆和大豆食品因其含有高品质的蛋白质及许多其他功能物质(如酚酸和异黄酮)，在亚洲一些国家常被用作健康食品和营养食材[1]。同时，由于大豆优异的功能特性、生物活性、高营养和低成本而被广泛用于畜禽饲料中。但大豆中的大豆凝集素、过抗原蛋白和胰蛋白酶抑制剂[2]等抗营养因子会导致幼年动物发生过敏反应[3]，并引起免疫功能障碍、生长抑制和腹泻等问题。抗原蛋白是大豆的主要致敏因子，以离心沉降速率可分为2S、7S(β-伴大豆球蛋白)、11S(大豆球蛋白)和15S 4种主要类型。其中β-伴大豆球蛋白作为一种糖蛋白，由α‘(分子质量约72 ku)、α(分子质量约68 ku)和β(分子质量约50 ku)亚基组成。β亚基的表位在仔猪、狗、鱼和兔中显示为抗原性，提示可能具有跨物种反应性，且在马和仔猪身上观察到对豆粕的阳性皮肤试验结果[4]。冷兆泽[5]研究发现，β-伴大豆球蛋白显著降低仔猪生长性能，影响血液生化指标和养分物质代谢率，使仔猪小肠黏膜绒毛长度显著降低而隐窝深度显著升高，并导致仔猪D-木糖吸收能力和小肠消化酶活性显著降低。

核因子-κB(NF-κB)是一种核转录因子，是炎症过程中的重要介质，广泛参与炎症性疾病的发生，其功能很大程度上是基于其在致炎细胞因子基因表达的中心作用，包括细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)也介导炎症和免疫反应[6-11]。肿瘤坏死因子TNF-α可刺激体内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的生成；高浓度的iNOS可以与细胞表面的受体结合，最终激活NF-κB；JNK和p38信号通路的激活会相应激活各种转录因子，而这些转录因子控制着炎症相关基因(包括iNOS和COX-2)的表达[12]。因此MAPK和NF-κB/iNOS信号通路的异常激活会促进炎症反应。大豆抗原蛋白诱导的仔猪过敏反应主要是T细胞2(Th2)型免疫反应，而TNF-α和INF-γ是Th2型免疫反应的重要产物，细胞因子IL-10主要由辅助性Th2产生，在过敏性炎症反应中发挥重要作用。Liu等[3]通过灌胃小鼠β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白，发现小鼠小肠组织中IL-10 mRNA 的表达量降低，IL-10 参与的免疫抑制反应是由p38 途径介导的。因此可以用TNF-α、INF-γ、IL-10含量来衡量β-伴大豆球蛋白对猪肠上皮细胞(IPEC-J2)的损伤程度。

二硫氨基甲酸肽吡咯烷(PDTC)作为一种NF-κB强效抑制剂，既能抵抗自由基的毒性作用，也能抑制促炎性细胞因子的生成[13]。Nω-硝基-L-精氨酸甲酯 (L-NAME)为一种非特异性NOS抑制剂，能同时抑制nNOS、eNOS和iNOS的表达[14]。SP600125可以抑制JNKmRNA的表达[15]。SB202190可抑制p38/MAPK信号通路，降低TNF-α浓度[16]。目前已有引起猪肠上皮细胞炎性损伤的多种信号通路的定性研究，如本课题组前期试验发现，β-伴大豆球蛋白通过p38、JNK和NF-κB信号通路引起IPEC-J2细胞损伤[17-18]。但细胞信号转导是多通路、多环节、多层次高度复杂的级联反应，目前仍缺少β-伴大豆球蛋白引起猪肠上皮细胞炎性损伤的多种信号通路的比较与定量研究。本试验在前期研究基础上，在体外培养的IPEC-J2细胞中添加β-伴大豆球蛋白及PDTC、L-NAME、SP600125、SB202190 4种抑制剂，研究其对IPEC-J2细胞活性以及相关炎性因子含量、蛋白和mRNA表达量的影响，分析β-伴大豆球蛋白通过NF-κB、iNOS、JNK和p38信号通路诱导IPEC-J2细胞损伤的机制，以期为探索β-伴大豆球蛋白引发仔猪肠道黏膜损伤的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

β-伴大豆球蛋白由中国农业大学食品工程学院提供(专利号：200410029589.4，中国)。IPEC-J2细胞购自武汉农业科学院细胞库；RPMI 1640培养基购自美国Thermo公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Biosharp；β-actin(MG 3)Mouse Monoclonal Antibody购自北京锐抗生物科技有限公司；HRP标记山羊抗兔IgG二抗和山羊抗鼠二抗，均购自Biosharp；p-NF-κB抗体(Ser 536)购自Santa cruz；iNOS蛋白购自Nuvos；PDTC、L-NAME、SP600125、SB202190，均购自碧云天生物技术公司；NO、TNF-α、IL-10、IFN-γ ELISA试剂盒，均购自上海科兴生物科技有限公司；CCK8购自Med Chem Express公司。

1.2 试验设计

试验采用随机分组设计。取对数生长期的IPEC-J2细胞, 以1×105个/mL的密度接种于6孔细胞培养板，置于37 ℃、体积分数5% CO2、饱和湿度下培养至细胞贴壁。试验设6组：对照组T0(细胞不做处理)，试验组T1(加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白)、T2(加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白+1 μmol/L PDTC)、T3(加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白+1 μmol/L L-NAME)、T4(加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白+1 μmol/L SP600125)和T5(加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白+1 μmol/L SB202190)。

1.3 试验方法

1.3.1 IPEC-J2细胞的显微结构观察 各试验组处理24 h后，将IPEC-J2细胞接种在玻片上，PBS洗涤3次；然后用体积分数4%聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，每次1 min。用苏木精将细胞染色3 min，自来水冲洗约5 min。再将细胞置于体积分数1%冰醋酸中用自来水冲洗约1 min，在曙红-磷脂溶液中染色1 min后，在无水乙醇中脱水。用光学显微镜观察细胞。

1.3.2 IPEC-J2细胞的超微结构观察 收集T0～T5组细胞，4 ℃环境下在体积分数2.5%戊二醛中固定1 h，二甲基苯二甲酸盐缓冲液中稀释。固定后，在碳酸氢钠(0.1 mol/L，pH 7.4)和氯化钙缓冲液(3 mmol/L)中洗涤，然后在缓冲液中用体积分数1%锇酸固定30 min，0 ℃下用体积分数2%醋酸铀酰染色过夜。使用 JEM-1230 TEM(JEOL,Akishima Tokyo,Japan)透射电镜观察细胞超微结构。

1.3.3 IPEC-J2细胞活性的CCK8检测 将IPEC-J2细胞以2×103个/孔接种到96孔板上，每孔100 μL，37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养24 h后，按试验分组加入对应溶液，继续培养24 h，每孔加入10 μL CCK8溶液，放入37 ℃培养箱培养1 h，直至出现明显的颜色反应。用酶标仪读取每孔的OD450 nm值，以细胞存活率表征细胞活性。细胞存活率=[(试验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

1.3.4 IPEC-J2细胞NO、TNF-α、IL-10、IFN-γ含量检测 收集T0～T5组细胞，1 000 r/min离心5 min，用PBS洗涤3次。之后向每组细胞中加入500 μL含体积分数0.1% Triton X-100的0.1 mol/L Tris-HCl(pH=7.4)，放入冰水中进行超声裂解。将细胞裂解液以1 000 r/min离心10 min，收取上清液，按照ELISA试剂盒说明书步骤测定NO、TNF-α、IL-10、IFN-γ含量。

1.3.5NF-κBp65、iNOS、JNK和p38的mRNA表达水平检测 收集T0～T5组细胞，用Trizol法提取RNA，紫外分光光度计于260 nm测定吸光度值，进行RNA纯度检测。采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8软件，设计NF-κBp65、iNOS、JNK和p38定量PCR引物，以Actin为内参，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。引物序列及参数见表1。

表1 NF-κB p65、iNOS、JNK和p38基因的引物序列Table 1 Sequences of primer genes related NF-κB p65,iNOS,JNK,and p38

1.3.6 NF-κB、iNOS、JNK和p38蛋白表达量检测 收集T0～T5组细胞，加入混有蛋白酶抑制剂以及蛋白磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，漩涡振荡器剧烈振摇5～10 s混合均匀，置于冰上20 min，使细胞充分裂解。之后14 000g离心10 min，收集上清液。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明进行操作，根据标准曲线计算蛋白浓度。将提取的蛋白质样品煮沸5 min，在SDS-PAGE凝胶中电泳后转移到PVDF膜上。用牛血清白蛋白(BSA)在室温下封闭膜4 h，再放入一抗4 ℃孵育过夜。将膜洗涤3次，并用HRP 标记山羊抗兔 IgG 二抗(1∶5 000稀释)在室温下水平振荡孵育45 min，洗膜后放入凝胶成像系统(Bio-Rad)中成像。Western blot检测NF-κB、iNOS、JNK、p38蛋白表达量。

1.4 数据处理

试验数据均以“平均值±标准差”表示，利用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，运用GraphPad Prism 7.0数据软件制图。采用Quantity One软件对Western blot结果进行灰度值分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对IPEC-J2细胞显微结构的影响

β-伴大豆球蛋白(T1)和NF-κB抑制剂PDTC(T2)、iNOS抑制剂L-NAME(T3)、JNK抑制剂SP600125(T4)、p38抑制剂SB202190(T5)对细胞显微结构的影响结果见图1。由图1可以看出，未经处理的T0组细胞数量密集，细胞完整，呈多边形贴壁。T1组细胞数量大量减少，细胞质降解，细胞核皱缩。而与T1组相比，添加抑制剂后的各组细胞数量均有所增加，细胞质降解现象减少，整体趋于完好；其中T2组细胞核完整，无皱缩，细胞数量增多，细胞形态及完整性接近T0组细胞；T3组细胞无皱缩，细胞质降解现象减少，整体较完整；T4、T5组细胞核无皱缩。说明加入β-伴大豆球蛋白后IPEC-J2细胞结构受到破坏，而4种抑制剂可以不同程度抑制这种作用，且PDTC(T2)的抑制效果最好。

2.2 不同处理对IPEC-J2细胞超微结构的影响

β-伴大豆球蛋白(T1)和NF-κB抑制剂PDTC(T2)、iNOS抑制剂L-NAME(T3)、JNK抑制剂SP600125(T4)、p38抑制剂SB202190(T5)对IPEC-J2细胞超微结构的影响结果见图2。图2显示，未经处理的T0组细胞结构正常，轮廓清晰；T1组细胞线粒体出现空泡，线粒体结构改变，染色质边集；T2、T3、T4、T5组细胞结构较完整，空泡减少，且T2组细胞完整性接近T0组细胞。说明加入β-伴大豆球蛋白后，IPEC-J2细胞超微结构受损，线粒体出现空泡，而4种抑制剂可以抑制细胞超微结构受到的损伤，且PDTC(T2)的抑制效果较强。

图2 β-伴大豆球蛋白和4种抑制剂对IPEC-J2细胞超微结构的影响(×20 000，80.0 kV)Fig.2 Effect of β-conglycinin and four inhibitors on ultrastructure of IPEC-J2 cells(×20 000，80.0 kV)

2.3 不同处理对IPEC-J2细胞活性的影响

β-伴大豆球蛋白(T1)和NF-κB抑制剂PDTC(T2)、iNOS抑制剂L-NAME(T3)、JNK抑制剂SP600125(T4)、p38抑制剂SB202190(T5)对IPEC-J2细胞活性的影响结果见图3。

图柱上标不同小写字母表示差异显著P<0.05，不同大写字母表示差异极显著P<0.01。下同Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05,and different uppercase letters indicate extremely significant difference at P<0.01.The same below图3 β-伴大豆球蛋白和4种抑制剂对IPEC-J2细胞活性的影响Fig.3 Effects of β-conglycinin and four inhibitors on activity of IPEC-J2 cells

由图3可以看出，与未经处理的T0组相比，T1组细胞活性极显著降低(P<0.01)。与T1组相比，T2、T3、T4、T5组细胞活性均极显著升高(P<0.01)；其中T2组细胞活性最高，极显著高于T4组(P<0.01)，显著高于T3、T5组(P<0.05)。说明加入β-伴大豆球蛋白后IPEC-J2细胞活性受到抑制，而4种抑制剂可以不同程度解除这种抑制作用，且PDTC(T2)解除抑制的效果显著强于其他抑制剂。

2.4 不同处理对IPEC-J2细胞NO、TNF-α、IL-10和IFN-γ含量的影响

β-伴大豆球蛋白和4种抑制剂对IPEC-J2细胞中NO、TNF-α、IL-10和IFN-γ含量的影响结果见图4。由图4可以看出，与未经处理的T0组相比，T1组细胞NO、TNF-α、IFN-γ含量都极显著升高(P<0.01)，而IL-10含量极显著减少(P<0.01)；与T1组相比，T2、T3、T4、T5组细胞IL-10含量均极显著升高(P<0.01)，而NO、TNF-α、IFN-γ含量均极显著减少(P<0.01)。说明加入β-伴大豆球蛋白后，IPEC-J2细胞中细胞因子NO、TNF-α、IFN-γ的含量升高，而IL-10含量降低，4种抑制剂可以不同程度解除这种促进或抑制作用。

图4 β-伴大豆球蛋白和4种抑制剂对IPEC-J2细胞NO、TNF-α、IL-10和IFN-γ含量的影响Fig.4 Effect of β-conglycinin and four inhibitors on contents of NO,TNF-α,IL-10 and IFN-γ in IPEC-J2 cells

2.5 不同处理对IPEC-J2细胞NF-κB p65、iNOS、JNK和p38的mRNA表达水平的影响

β-伴大豆球蛋白和4种抑制剂对IPEC-J2细胞中NF-κBp65、iNOS、JNK和p38的mRNA表达水平的影响结果见图5。

图5 β-伴大豆球蛋白和4种抑制剂对IPEC-J2细胞NF-κB p65、iNOS、JNK和p38的mRNA表达水平的影响Fig.5 Effects of β-conglycinin and four inhibitors on mRNA expression levels of NF-κB p65,iNOS,JNK and p38 in IPEC-J2 cells

由图5可以看出，与未经处理的T0组相比，T1组细胞中NF-κBp65、iNOS、JNK和p38的mRNA表达量均极显著增高(P<0.01)。与T1组相比，T2、T3、T4、T5组细胞中NF-κBp65 mRNA表达量均极显著降低(P<0.01)，iNOS、JNK、p38 mRNA表达量均显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)。说明加入β-伴大豆球蛋白后，IPEC-J2细胞中NF-κBp65、iNOS、JNK和p38的mRNA表达水平升高，而4种抑制剂可以不同程度抑制这种作用。

2.6 不同处理对IPEC-J2细胞NF-κB、iNOS、JNK和p38蛋白表达量的影响

β-伴大豆球蛋白(T1)和NF-κB抑制剂PDTC(T2)、iNOS抑制剂L-NAME(T3)、JNK抑制剂SP600125(T4)、p38抑制剂SB202190(T5)对IPEC-J2细胞中NF-κB、iNOS、JNK、p38蛋白表达量的影响结果见图6和图7。图6显示，加入β-伴大豆球蛋白后，上述4种蛋白表达量均明显减少，而加入抑制剂后，蛋白表达有所恢复。由图7可以看出，与细胞未经处理的T0组相比，T1组细胞中的NF-κB、iNOS、JNK、p38蛋白表达量极显著上升(P<0.01)。与T1组相比，T2、T3、T4、T5组细胞中相关蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)。说明加入β-伴大豆球蛋白后，IPEC-J2细胞中NF-κB、iNOS、JNK、p38蛋白表达量升高，而4种抑制剂不同程度地抑制了这种作用。

图6 添加β-伴大豆球蛋白和4种抑制剂的NF-κB、iNOS、JNK和p38蛋白表达Fig.6 Add β-conglycinin and four inhibitors on protein bands of NF-κB,iNOS,JNK and p38

图7 β-伴大豆球蛋白和4种抑制剂对IPEC-J2细胞NF-κB、iNOS、JNK和p38蛋白表达量的影响Fig.7 Effects of β-conglycinin and four inhibitors on expression levels of NF-κB，iNOS，JNK and p38 proteins in IPEC-J2 cells

3 讨 论

NO由iNOS催化l-精氨酸产生[19-20]，但iNOS过量生产NO会形成反应性氮，导致机体周围组织细胞死亡并破坏组织稳态[21-22]。丁国雷等[23]通过给小鼠双侧腹股沟和腋窝皮下注射猪心肌肌凝蛋白、腹腔注射百日咳毒素制作小鼠实验性自身免疫性心肌炎(EAM)模型，模型组小鼠血清中NO含量和iNOS蛋白表达量均上升，而注射L-NAME的小鼠心肌中iNOSmRNA表达、血清iNOS活性以及NO含量比正常组明显降低。彭成璐等[17]在IPEC-J2细胞中添加大豆抗原蛋白后，细胞中IL-10含量极显著降低，而NO含量极显著增高，NF-κB p65、iNOS蛋白表达量和mRNA表达水平均极显著增高，光镜下观察到大量细胞脱落，细胞形态异常；而加入PDTC提高IPEC-J2细胞活性，促进NO分泌，并抑制IL-10的分泌，同时提高了NF-κB、iNOS的蛋白表达量及NF-κBp65、iNOSmRNA表达水平，这与本试验结果一致。本研究发现，在IPEC-J2细胞中添加β-伴大豆球蛋白后引起细胞损伤，IL-10含量下降，而NO含量上升，NF-κBp65、iNOSmRNA表达水平升高，iNOS、NF-κB蛋白表达量上升，HE染色后观察发现胞质降解，细胞结构遭到破坏，电镜下细胞核皱缩，出现大量空泡和染色质边集现象；而添加L-NAME或PDTC后，NF-κBp65、iNOSmRNA表达水平，NF-κB、iNOS活性及NO含量均显著下降，HE染色观察细胞无皱缩，细胞降解的现象减少，整体较完整，说明β-伴大豆球蛋白通过NF-κB/iNOS信号通路引起IPEC-J2细胞炎性损伤，添加PDTC和L-NAME后抑制了这种作用。

Lee等[24]研究发现，在体外培养细胞IPEC-J2中加入脂多糖可引起细胞炎性损伤，细胞中TNF-α、IFN-γ表达增加。Peng等[25]向IPEC-J2细胞中添加大豆抗原蛋白后，TNF-α含量增加，核染色质凝结和横向移位。彭成璐等[17]在添加了β-伴大豆球蛋白的猪肠上皮细胞(IPEC-J2)中加入SP600125和SB202190后，JNK、p38蛋白表达量极显著降低，证明β-伴大豆球蛋白通过p38/JNK信号通路引起仔猪肠上皮细胞损伤。本试验结果与此一致，即未加入抑制剂前，添加β-伴大豆球蛋白引起细胞活性下降，NO、TNF-α、IFN-γ含量显著增加，JNK、p38 mRNA表达水平及蛋白表达量增加，胞质溶解，胞核皱缩，染色质边集；而加入抑制剂后细胞活性提高，JNK、p38蛋白表达量和mRNA表达水平下降，细胞完整性恢复，空泡减少，其中加入PDTC的细胞结构和细胞器结构最完整，细胞活性显著高于其他抑制剂。