基于微纳米金属有机框架的汗液生物传感研究

陈至威 陈艳霞＊ 秦雷

北京信息科技大学传感器北京市重点实验室，北京 100101

0 前言

目前，人们越来越重视自身的健康状况，血液也一直被认为是检测人体健康的首选分析物。但是，抽血检查容易受到感染，具有一定的创伤性。相比之下，汗液检测是一种非侵入性的分析手段，汗液较容易在表皮上获取和收集，而且汗液中含有多种与健康评估和疾病诊断有关的生物标志物[1]，如pH、葡萄糖、乳酸、蛋白质、钙离子、氯离子等。因此，汗液传感分析作为一种无创检测方式，对于疾病诊断有着极其重大的意义。

随着纳米材料的引入，基于纳米材料的新型生物传感界面发展迅速[2]。金属有机框架（metal-organic framework，MOF）材料是一类新型多孔晶体材料[3]，是由金属离子/团簇和有机桥接配体配位而成的一维、二维或三维结构。金属有机框架具有结构与孔道尺寸可调控性、多孔性、比表面积大、组成多样、金属位点不饱和性等特点[4-5]。近年来，金属有机框架也作为一种新兴传感材料被广泛应用于食品、环境、重金属、有毒气体等检测[6-11]。郭颖等人[6]利用分子印迹聚合物、石墨烯量子点以及金属有机框架制备了一种荧光传感器，用于检测食品中的强力霉素，其检出限低至0.029 mg/L。刘娜等人[7]利用金属有机框架材料掺杂的水凝胶（PAAM-SA/MOF）快速萃取和检测养殖水体中孔雀石绿。韩璐等人[8]利用3种镧系元素Ce、Tb、Gd合成了金属有机框架纳米酶，并将其用于多巴胺（DA）的快速、灵敏检测，其检出限为6.47×10-8M。赵吉星等人[9]以Zn/Co-ZIF为前驱体，制备了双金属MOF衍生ZnCo多孔碳骨架，并用它来修饰电极，制备出一种新型的电化学传感器，用于水环境中Hg(Ⅱ)的检测，具有较好的灵敏度和较低的检测限。DANG W等人[10]制备出AuNPs-NH2/Cu-MOF复合材料，用其修饰玻碳电极（GCE），用于H2O2的电化学检测。刘金彤等人[11]设计了一种多功能的金属有机框架发光探针，用于对烯啶虫胺的高灵敏检测，检测限可达0.16 μg/mL。

目前，基于金属有机框架材料的荧光生物传感器、电化学生物传感器等，多借助外用精密设备，检测流程较为复杂，且其在汗液生物传感中的应用较少。本研究设计了一种基于微纳米金属有机框架的汗液生物传感界面，用于人体汗液的比色检测。这种微纳米金属有机框架制备方法简单，成本低廉，稳定性好，可以长时间保存。本研究通过比色法对汗液中的葡萄糖、pH进行检测，可以较为直观地观察到反应过程中的颜色变化，操作方便，检测快速、灵敏。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 试剂与材料

载玻片（25.4 mm×76.2 mm×1 mm，帆船牌）、六水合硝酸锌（（Zn(NO3)2·6H2O，99%，国药集团化学试剂有限公司）、三乙胺盐酸盐（C6H16ClN，99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、2-甲基咪唑（C4H6N2，98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、乙醇（75%，Sigma-Aldrich公司）、甲苯（C7H8，Sigma-Aldrich公司）、十八烷基三氯硅烷（OTS，95%，Sigma-Aldrich公司）。

葡萄糖标准溶液（5 mmol/L）、葡萄糖检测试剂盒、紫色石蕊指示剂、酸碱溶液（pH为5.0～8.0）均购自伊势久生物科技有限公司。实验所用的水为去离子水、超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器

数控超声波清洗机（KQ3200DE）、电热恒温干燥箱（DHG-9031A）、电热鼓风干燥箱（DHG-9075A）、等离子清洗机（CPC-A）、紫外臭氧清洗机、光学接触角张力测试仪（LSA-100）、扫描电子显微镜（SEM）、智能手机（Android）。

1.2 实验部分

1.2.1 微纳米金属有机框架的制备

将载玻片用超声波清洗器清洗后，放入40 ℃的鼓风干燥箱中烘干，然后将烘干的载玻片放置在玻璃培养皿中，用等离子清洗机清洗，用乙醇清洗称量瓶，并自然晾干。

称取150 mg六水合硝酸锌，70 mg三乙胺盐酸盐，120 mg二甲基咪唑，将其倒入盛有50 mL超纯水的离心管中混匀。将清洗干净的载玻片放置在称量瓶中，取25 mL配制好的溶液倒入称量瓶中，用封口膜密封好，将其放到80 ℃的恒温干燥箱中沉积24小时，制得微纳米金属有机框架基底。

1.2.2 表面改性

用乙醇将称量瓶清洗干净，自然晾干，将所制得的微纳米金属有机框架基底用等离子清洗机处理5分钟。

用移液枪分别取10 mL的甲苯与100 μL的十八烷基三氯硅烷，加入称量瓶中混匀；然后将洁净的载玻片放入称量瓶中，用封口膜密封好，在避光处静置30分钟；半小时后取出载玻片，用无水乙醇轻轻冲洗，然后放入120 ℃的鼓风干燥箱中烘干10分钟或自然晾干，以获得表面改性的样品；接着，在样品表面覆盖上定制的掩模板，置于紫外臭氧清洗机中图案化处理10分钟，得到超浸润微孔传感界面。

1.2.3 工作液及浓度梯度溶液配制

配制葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（GOD-POD）工作液；另外，利用双蒸水（ddH2O）配制浓度梯度为 0 mmol/L、1.25 mmol/L、2.5 mmol/L、3.75 mmol/L、 5 mmol/L的葡萄糖梯度溶液，备用。

1.2.4 功能化底物修饰

用移液枪取1 μL GOD-POD工作液滴加在微孔中进行功能化修饰，待溶剂挥发后（室温下自然静置10分钟），用于检测葡萄糖的活性成分会负载到微孔中，以获得用于检测汗液中葡萄糖的检测区域。

用移液枪取1 μL紫色石蕊指示剂滴加在微孔中进行功能化修饰，待溶剂挥发后（室温下自然静置10分钟），用于检测pH的活性成分会负载到微孔中，以获得用于检测汗液pH的检测区域。

1.2.5 检测

用移液枪取1 μL待测液滴加在功能化修饰过的微孔检测区，观察颜色反应变化。

1.3 表征

1.3.1 样品表征

样品的表面微观形貌采用扫描电子显微镜进行表征，样品的接触角采用LSA-100光学接触角张力测试仪进行测量。

1.3.2 传感器比色表征

用手机拍摄相同反应时间的不同浓度葡萄糖及不同pH值的比色图像，并用分析软件将其数值化为RGB信号的变化趋势，作出检测柱状图。

RGB，指的是常用的RGB模型，它以R（Red，红）、G（Green，绿）、B（Blue，蓝）3个通道为基础，且这3个组分的值的范围均为0到255。当这3种基本色以不同比例进行混合时，会产生不同的颜色。这意味着，在一般情况下，每种颜色均可由其对应的RGB值进行数值化表示。

2 结果与讨论

2.1 样品表征

图1为微纳米金属有机框架在扫描电子显微镜下的表面微观形貌图像。从图中可以看出，金属有机框架呈大小均匀的米粒状，参差不齐，相互交叠，孔隙较多，具有较高的粗糙度及较大的比表面积，有利于待测物的牢固吸附与富集，可以提高检测灵敏度。

图2（a）为制备出的微纳米金属有机框架在光学接触角张力测试仪下的图像，当2 μL的液滴触碰到微纳米界面后会完全铺展，接触角接近于0°，呈超亲水性；图2（b）为微纳米金属有机框架经表面改性后在光学接触角张力测试仪下的图像，接触角为154.3±3.0°，呈超疏水性，因此，通过图案化处理形成的超疏水-超亲水传感界面能够使待测液滴完全限制在超亲水区域内；图2（c）为2 μL不同浓度的紫色染料滴加到图案化传感界面的实物图，从图中可以看出，由于浸润性差异，液滴完全位于超亲水微孔中且没有溢出，液滴之间不会互相干扰，这使得待测液滴能够富集在检测区域内，有利于后续样本的分析检测。

2.2 检测性能

2.2.1 葡萄糖检测

葡萄糖氧化酶能够催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，继而产生红棕色络合物。图3是葡萄糖溶液在浓度梯度为0 mmol/L、1.25 mmol/L、2.5 mmol/L、3.75 mmol/L、5 mmol/L的检测柱状图，从图中可以看出，随着葡萄糖溶液浓度的增加，其对应的R、G、B值有着明显的变化趋势，都随着葡萄糖溶液浓度的增加而显著降低。

2.2.2 pH检测

紫色石蕊试剂是一种常用的酸碱指示剂，遇酸变红，遇碱变蓝。图4是pH为6、6.5、7、7.5、8的检测柱状图，从图中可以看出，随着pH值的变大，溶液由酸性变为碱性，其对应的R值逐渐减小，G、B值的整体趋势呈先增大后减小。

2.3 人体汗液检测

收集志愿者有氧运动半小时后的汗液，取1 μL滴加在基于微纳米金属有机框架的功能化微孔中，进行实际人体汗液的葡萄糖与pH检测，分别进行6组检测。

图5（a）是实际汗液的葡萄糖检测柱状图，与图3进行比对，可以得出，该志愿者的汗液中几乎没有葡萄糖，健康状况良好。

由于出汗率的差异，人体汗液的pH值正常范围一般为4.2～7.5。图5（b）是实际汗液的pH检测柱状图，与图4进行比对，可以得出，该志愿者的汗液pH值在6.5～7之间。

上述检测结果可以得出，本研究的基于微纳米金属有机框架的生物传感界面可实现人体汗液的高灵敏、可靠检测，具有一定的实际应用价值。

3 结束语

本研究制备了微纳米金属有机框架，对其进行表面改性、图案化处理以及功能化修饰，设计出了一种制备简单、成本低、稳定性好的汗液生物传感界面。这种基于微纳米金属有机框架的汗液生物传感界面实现了葡萄糖、pH的准确比色分析，可用于实际人体汗液检测。本研究的基于微纳米金属有机框架的汗液生物传感界面，在多组分生物传感和生物医学等领域具有巨大的潜在应用前景。