温度对大鳞副泥鳅肠道菌群组成的影响研究

2022-02-24刘艳丽吕惠蓉李海东高阳

中国水产 2022年1期

文/刘艳丽吕惠蓉李海东高阳

温度是影响机体生长的重要因子。有研究表明温度通过影响消化和代谢等，进而影响机体存活与生长。肠道是鱼类重要消化器官，定植着丰富的微生物群落，温度会对肠道微生物产生直接影响。如全紫娇等在研究不同温度条件下养殖刺参的肠道菌群结构时发现，优势菌群在不同温度下占刺参肠道菌群的比例互不相同。石萍等在研究温度骤变对日本医蛭肠道菌群的影响时发现，温度变化时主导菌多样性组成及丰度会产生变化，进而影响其生存状态。温度密切影响机体及其肠道微生物群落，然而在有关温度对水生物肠道菌群产生影响的研究中，较少见到温度与大鳞副泥鳅肠道菌群组成结构的关系研究。本研究旨在分析不同温度下大鳞副泥鳅肠道菌群多样性的变化及其原因，以期为其合理养殖提供理论依据。

一、材料与方法

（一）实验设计

实验用鱼来源于舟山某公司。在正式实验前，将泥鳅暂养7d，保持养殖水温为20℃，每日采用商业饲料对其进行两次（8:00和18:00）饱食投喂。暂养结束后，选取体格健壮、活力较强、大小均匀（15.4±0.7）g的个体用于实验。将180尾泥鳅随机分成三组，分别标记为高温组（G1）、对照组（F）和低温组（G2），对应水温分别为28℃、20℃和12℃，每组设3个重复，每个重复20尾，分别置于9个20L塑料水箱中养殖。通过加热棒和冷水机来控制温度，实验时间持续14d，每天换水1/4。实验期间水体pH为6.5～7.5，溶氧含量为6.1mg/L～7.3mg/L，每日对其饱食投喂两次。

（二）实验方法

1.样品采集

实验结束后禁食24h，从每个平行组中随机取5条泥鳅作为样本，利用MS-222浸泡法进行麻醉，使用70%乙醇擦拭泥鳅体表消毒。取样时采用无菌操作，沿泥鳅体侧剪开并将肠道完整分离，再将其肠道表面的黏液和脂肪分离完毕，后挤出肠道内容物，放入干净的离心管中，保存于-80℃冰箱内。

2.提取DNA及PCR扩增

在各处理组的3个重复组里分别取3条泥鳅肠道样品，混合研磨提取DNA，最终将DNA提取物混合并保存于1.5mL离心管中。对DNA样品进行浓度和质量的验证，确保满足后续操作要求。扩增DNA片段时，程序如下：预变性94℃，3min，变性94℃，20s；退火55℃，20s；复性72℃，30s，变性、退火、复性共25次循环，72℃终延伸5min。二轮扩增中引入兼容的Illumina PCR引物后，进行（95℃，30s；95℃，15s；55℃，15s；72℃，30s；72℃，5min）共5次循环。PCR反应体系10.0μL：10×PCR Buffer 5.0μL，dNTPs（10mmol/L）0.5μL，上、下游引物各（50μmol/L）0.5μL，Plantium Taq（5U/μL）0.5μL，DNA模板10.0ng，加灭菌水补足至10.0μL。

3.Illumina MiSeq测序

将扩增得到的样品送到上海生工生物工程股份有限公司进行双端测序，测序前通过琼脂糖凝胶提取PCR产物，使用Illumina MiSeq测序平台深度测序时，根据说明书进行操作，通过Qubit 2.0检测试剂定量检测被提取出来的DNA。

4.数据处理

利用prinseq进行质量控制，以过滤掉样品中可能会混杂的其它物质，过滤后使用Flash进行序列拼接。利用uclust在97%相似度下进行聚类，并与OTU代表序列进行比对。采用Mothur软件进行α多样性分析，包括Chao1丰富度指数、ACE指数、Shannon多样性指数和Simpson多样性指数、稀释性曲线。使用qiime、R语言和SPSS 23.0软件计算并分析以上数据，方便对样品间菌群结构差异进行比较分析。

二、结果与分析

（一）物种相似度分析

对不同温度控制下的三个实验组进行分析，研究温度胁迫对大鳞副泥鳅肠道菌群的影响，利用Venn图分析高温组、对照组和低温组菌群间的物种相似度。结果显示（见图1），三组实验对象肠道菌群总OTUs数为9321，共有的OTUs数为824，占所有OTUs数的8.80%，此外，F组特有OTUs数为2773，占所有OTUs数的29.75%；G1组特有OTUs数为2035，占所有OTUs数的21.83%；G2组特有OTUs数为2262，占所有OTUs数的24.27%。F组的大鳞副泥鳅肠道菌群OTUs数为4645，高于另外两组的OTUs数，且大多数OTUs是变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的序列。这说明温度胁迫对大鳞副泥鳅肠道的菌群组成有一定影响。

图1 Venn图显示出高温组、低温组和对照组各有和共有的OTUs数

（二）温度胁迫对泥鳅肠道菌群多样性的影响

Alpha多样性分析表明G1、G2组微生物丰富度相比F组低（见图2）。ACE指数和Chao1指数可以估计大鳞副泥鳅肠道的菌群丰度，图2A、B显示F组中ACE和Chao1估计值最高，表明生活在20℃环境下大鳞副泥鳅的肠道菌群丰富度比12℃、28℃组高；Shannon指数的稀释性曲线可以估计样本的群落多样性，指数越大代表群落多样性越高，图2C中显示从小于5000个序列的位置开始趋向于水平，并且，明显可以看出F组Shannon指数高于其他两组；Simpson指数越小代表群落多样性越高，图2D显示F组的Simpson指数低于另外两组，这一结果同Shannon指数估计结果一致，同样说明F组大鳞副泥鳅拥有最高的肠道菌群群落多样性。

图2 指数稀释性曲线

（三）菌群结构分析

1.基于门水平上的菌群结构

根据菌群结构分析（见图3），可得到门水平上不同温度下大鳞副泥鳅的菌群分布（见表1），结果显示，三组实验对象肠道中厚壁菌门的OTUs数非常稳定，其丰富度几乎不随外界温度变化而变化。不同温度下大鳞副泥鳅的肠道菌群中有相同的次优势菌群：厚壁菌门、拟杆菌门，但优势菌群却不尽相同，软壁菌门大量出现在G2组，而在其余两组中占比极小，F组和G1组中优势菌群为变形菌门，相对占比分别为62.23%和52.16%，即20℃环境下大鳞副泥鳅肠道菌群中变形菌门丰富度最高。

表1 基于门水平上不同温度下大鳞副泥鳅的肠道菌群分布

图3 门水平上各组不同菌群的分布图

2.基于属水平上的菌群结构及聚类分析

根据菌群结构属水平上的聚类分析（见图4）得到属水平上不同温度下各组优势菌属分布情况（见表2）。结果显示，菌群结构受温度影响，不同温度下大鳞副泥鳅的肠道菌群在属水平上的菌群结构存在较大差异，F组、G1组和G2组优势菌属各不相同，分别为沙雷氏菌属（）、不动杆菌属（）、脲原体属（），而乳杆菌属（）、乳球菌属（）和芽孢杆菌属（）在三组中都有分布。

表2 基于属水平上不同温度下大鳞副泥鳅的肠道菌群分布

图4 属水平上各组不同菌群的分布图

图5A为基于属水平上F组泥鳅肠道菌群丰度最高的前十类菌群结构与G1组的对比情况（＜0.05），在变形菌门中，F组的沙雷氏菌属数量多于G1组，而G1组中不动杆菌属和气单胞菌属数量明显多于F组，两组中同属厚壁菌门的乳酸球菌属和明串珠菌属占比十分相近。图5B为基于属水平上F组泥鳅肠道菌群丰度最高的前十类菌群结构与G2组的对比情况（＜0.05），沙雷氏菌属在F组相较G2组占绝对优势，同时，F组中不动杆菌属和气单胞菌属的数量也明显少于G2组，而贪嗜菌属、乳酸球菌属及明串珠菌属在两组中数量差异不大，这一结果与F组和G1组对比趋势相同。图5C为基于属水平上G1组泥鳅肠道菌群丰度最高的前十类菌群结构与G2组的对比情况（＜0.05），G1组中念珠菌属和嗜纤维细胞数量远远多于G2组，而G2组中酸土单胞菌属占比远大于G1组。三组中菌群结构的分布差异也说明温度对大鳞副泥鳅的肠道菌群分布具有一定影响。

图5 属水平上F组、G1组和G2组菌群结构两两对比情况

三、讨论

本文研究了三组不同温度（28℃、20℃和12℃）下大鳞副泥鳅的肠道菌群结构，检测到F组泥鳅的肠道菌群OTUs高于另外两组，且大多数OTUs是变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门的序列。泥鳅肠道菌群Alpha多样性结果显示，F组的ACE和Chao1指数和Shannon、Simpson指数相较G1、G2组更高，表明不同温度会影响泥鳅肠道内微生物群落的定植，改变肠道菌群的丰度和多样性。Huyben等研究发现水温的升高改变了虹鳟鱼肠道菌群的菌群多样性和丰度。Fontaine等在研究中发现蝾螈肠道菌群的Shannon指数在20℃环境下要比10℃、15℃环境下低8.3%，认为温度升高会使其肠道菌群多样性降低。在本研究中，20℃环境下泥鳅肠道菌群多样性相比其他两组更高，这可能和物种适宜生存温度相关。

本研究分析得出，F组和G1组大鳞副泥鳅肠道菌群的优势菌门均为变形菌门，且三组研究对象的次优势菌门均为厚壁菌门、拟杆菌门。这与管婷婷等相关研究中发现泥鳅幼鱼肠道中变形菌门均占优势地位的结果一致。G2组中软壁菌门的数量占据优势，说明温度变低可能会使变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门在定植位点的竞争上失去优势。变形菌门中的沙雷氏菌属存在于各组泥鳅肠道内，在自然界中也广泛存在，是水中常居菌群，但此研究中显示沙雷氏菌属只在F组中属于优势菌群，在G2组中极少存在，表明在相对低温下泥鳅肠道菌群结构会发生改变，温度会影响沙雷氏菌属的定植。同时，变形菌门的气单胞菌属在各组中的占比存在差异，即气单胞菌属在F组和G1组中占比较少，而在G2组中占比最多。气单胞菌属是一种革兰氏阴性的兼性厌氧菌，且多数已经被鉴定为鱼类、两栖类等一些动物的致病菌。根据高通量测序结果，G1组拟杆菌门数量明显高于其余两组，拟杆菌门的优势菌群为黄杆菌属，黄杆菌属中的多数成员为条件致病菌。因此，根据研究结果，我们认为高温和低温可能会使致病菌丰度增加，影响机体的存活，这对研究通过控制养殖水温防控大鳞副泥鳅的细菌性疾病提供了一定的理论支持。

本研究中厚壁菌门在各组分布差异并不明显，在各组的主要属为乳酸菌属、芽孢杆菌属。乳酸菌包括乳杆菌属、乳球菌属等菌属，存在于很多鱼类肠道内，可以将碳水化合物转化为乳酸，降低肠道pH，而偏酸性的肠道环境是抑制大多数致病菌的重要因素。可见乳酸菌能对鱼类肠道起到保护作用，能够增强水生动物的抗菌能力，是一种有益菌。芽孢杆菌属可以对多种细菌和真菌等病原体发挥体外拮抗或抑制作用，产生消化酶，激活生长因子，进而调节水生动物的免疫力。在本次实验中，我们发现各组中乳酸菌属和芽孢杆菌属的占比相差不大，表示温度可能对这两个菌属的定植影响较小，但研究结果对配制和开发促进泥鳅生长及免疫的有益菌剂人工饲料等有一定启示作用，需要进一步探究。