蛋白磷酸酶C1-TEN在急性髓系白血病细胞中的表达及抑制FLT3-ITD对其表达的影响

罗满生，赖旭旺，邓晓玲，曾艳梅

（1.南昌大学 附属赣州医院 检验科，江西 赣州 341000；2.南昌大学 医学部 第二临床医学院，江西 南昌 330006；3.南昌大学 附属赣州医院 中心实验室，江西 赣州 341000）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一类因某些基因突变而导致的造血系统恶性增殖性疾病，严重威胁人类健康，其中FMS样酪氨酸激酶3（FMS like tyrosine kinase 3，FLT3）中间串联重复（internal tandem duplication，ITD）突变在临床初诊AML患者中约占30%［1］。现已知FLT3-ITD突变与AML耐药、复发、完全缓解率低等不良预后密切相关［2-3］。研究发现FLT3-ITD可通过激活下游系列信号通路如磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）／蛋白激酶B（Akt）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、信号转导和转录激活因子 5（signal transducer and activator of transcription 5，STAT5）等，诱发造血祖细胞异常增殖和恶性转化，从而具有致白血病作用［4］。目前已有第一、二代酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）用于FLT3-ITD突变AML的治疗，但效果不理想［5-6］。因此，AML发病机制及其治疗仍然是当前AML研究领域的热点。

ITD突变导致FLT3非配体依赖性二聚化，并持续激活，而酪氨酸激酶活性的调节通常受控于一些蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphotase，PTPase）［7］。因此，在FLT3-ITD激活方面，PTPase可能具有一定调节功能。然而在诸多研究中，有关PTPase的确切作用观点尚不一致［8-9］，而具有C1结构域且与TENsin同源的磷酸酶（C1 domaincontaining phosphatase and TENsin homologue，C1-TEN）就是其中代表。

C1-TEN，亦称作人张力蛋白2（tensin 2，TNS2），是tensin家族成员之一［10-11］。由于其C末端所特有的蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphotase，PTP）和Src同源结构域（Src homology domain，SH2），C1-TEN因而可能具有酪氨酸残基磷酸化活性［12-13］。虽然C1-TEN在一些肿瘤细胞中具有抗肿瘤功能［9］，但有学者则提示该磷酸酶可能具有致瘤作用［8］，而有关C1-TEN在AML细胞的表达及其功能目前尚无报道。本研究将首先揭示AML细胞中C1-TEN的表达情况，然后探讨AML细胞中FLT3-ITD与C1-TEN的调控关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系

AML细胞系HL-60细胞、MV4-11细胞均由中科院（上海）干细胞库馈赠。实验细胞正常培养于含10%热灭活胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的RPMI-1640培养基，铺板、药物干预时悬浮于2% FBSRPMI-1640。

1.1.2 试剂与仪器

米朵妥林（Midostaurin，货号：HY-10230）、索拉菲尼（Sorafenib，货号：HY-10201）购自上海MCE公司；FBS、RPMI-1640购自Gibco公司；MTT试剂（货号：298-93-1），购于上海生工生物科技有限公司；15，16-二氢丹参酮I（15，16-dihydrotanshinone I，DHTS，货号：SLBX2742）、二甲基亚砜购自默克Sigma公司；组织细胞裂解液（货号：R0010）购自索莱宝公司；0.45μm PVDF膜购自Millipore公司；蛋白酶／磷酸酶抑制剂混合物（货号：4906845001）购自Roche公司；Tris／甘氨酸／SDS电泳缓冲液（货号：PS105S）、转膜缓冲液（货号：PS109S）、TBST（货号：PS103S）、快速封闭液（货号：PS108P）、三色预染Mraker（货号：WJ103）、ECL超敏化学发光试剂均购自上海雅酶生物科技有限公司；兔源FLT3抗体（货号：3462S）、pFLT3抗体（货号：3464S）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）抗体（货号：9661）、多聚ADP核糖体聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抗体（货号：9532）、鼠源C1-TEN抗体（货号：11990S）等均购自CST公司；兔源β-actin抗体（货号：TA-09）、羊抗鼠IgG 抗体（货号：ZB-2305）、羊抗兔IgG抗体（货号：ZB-2301）等购自北京中杉金桥公司；兔源α-Tubulin抗体（货号：11224-1-AP）购自Proteintech公司；CCK-8细胞活性检测试剂盒（货号：N31213）购自北京Transgen公司；Annexin V-APC／7-AAD（E-CK-A218）购自武汉Elabscience生物科技有限公司。

KHB-ST-360酶标仪购自上海科华生物工程股份有限公司，FACSCantoTMⅡ流式细胞仪购自美国BD公司，FUSION FX凝胶成像仪购自法国Vilber公司。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT检测AML细胞活性

基于前期预实验结果，本研究分别以不同浓度的索拉菲尼（0、10、20、40、80 nmol／L）、米朵妥林（0、250、1 000、4 000 nmol／L）干预MV4-11细胞；同样，以不同浓度的索拉菲尼（0、400、800、1 600、3 200 nmol／L）、米朵妥林（0、250、1 000、4 000 nmol／L）干预HL-60细胞。利用MTT法检测HL-60细胞、MV4-11细胞的活性，以分析两者对TKI的敏感性。具体步骤参照文献［14］。细胞经PBS两次洗涤后悬浮于2%FBS-RPMI-1640，于96孔板中每孔加入90μL细胞混悬液（含3.0×104个细胞），然后加入10μL RPMI-1640或不同浓度的米朵妥林或索拉菲尼，37℃、5% CO2孵育20 h。每孔加入20μL MTT试剂（5 mg／mL），4 h后加150μL二甲基亚砜，混匀后酶标仪读板，测定各孔吸光度D（490 nm），实验设三复孔，取均值。

1.2.2 Western blot检测蛋白表达

基于MTT实验结果，确定HL-60细胞、MV4-11细胞的米朵妥林干预浓度和索拉菲尼干预浓度，同时以RPMI-1640、10%FBSRPMI-1640为实验对照，于37℃、5%CO2条件下共育5 h。（1.5～2.0）×106个细胞经1 200 r／min离心6min，细胞沉淀用预冷PBS洗涤2次，加100μL RIPA细胞裂解液，其中含蛋白酶／磷酸酶抑制剂混合物（1 mmol／L），充分吹打、涡旋混匀，100℃金属浴10 min，12 000 r／m离心7 min，4℃保存备用。10% SDS-PAGE电泳后，转移至PVDF膜，快速封闭液室温封闭1 h，经TBST（含0.1%吐温-20，下同）洗涤1次后分别4℃孵育一抗过夜，包括兔源FLT3抗体（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶1 000）、pFLT3抗体（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶1 000）、caspase-3抗体（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶1 000）、PARP抗体（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶1 000），鼠源C1-TEN抗体（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶1 000）、α-Tubulin抗体（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶50 000）、β-actin抗体（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶1 000）。TBST洗涤5次，5 min／次，再室温孵育HRP标记的二抗1 h，包括羊抗鼠IgG抗体（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶10 000）；羊抗兔IgG抗体（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶10 000）。TBST洗涤5次，5 min／次，ECL超敏化学发光试剂显影，FUSION FX凝胶成像仪曝光成像并分析灰度值。

1.2.3 CCK-8实验检测MV4-11细胞活性

MV4-11细胞铺96孔板（每孔90μL细胞混悬液，含3.0×104个细胞），分别用不同浓度的DHTS（0、2.5、5、10μmol／L）于37℃、5% CO2条件下干预15 h，加入10μL CCK-8试剂后孵育3 h，利用酶标仪读取各孔吸光度D（450 nm），每组设3复孔，取均值。

另外，基于预实验结果，本研究还将通过检测细胞活性探讨DHTS（3.0μmol／L）与米朵妥林（50 nmol／L）或索拉菲尼（10 nmol／L）对MV4-11细胞的协同抑制作用，方法同上。

1.2.4 FACS、Western blot检测MV4-11细胞凋亡

MV4-11细胞铺24孔板（每孔900μL细胞混悬液，含3.5×105个细胞），分为阴性对照组（Con）和实验组，分别加100μL RPMI-1640或DHTS（100μmol／L），37℃、5%CO2孵育5 h，依照试剂盒说明进行Annexin V-APC／7-AAD标记，上机行流式细胞检测（FACS）。caspase-3、PARP活化情况通过WB检测相关蛋白表达进行分析，方法同1.2.2。

1.3 统计学分析

所有数据运用GraphPad Prism 7.0进行统计学分析，以均数±标准差（¯x±s）表示。计量资料多组间比较运用单因素方差分析（one-way ANOVA）分析，Bonferroni post-hoc法检验方差齐性；两组间比较采用非配对t检验分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TKI对MV4-11细胞活性的影响

与之前报道［15］一致，本研究中两种TKI（索拉菲尼、米朵妥林）均可有效抑制FLT3-ITD突变AML细胞系MV4-11细胞的增殖，而HL-60细胞则对其耐药。如图1A-B，两种TKI均能显著杀伤MV4-11细胞。与Con组（0 nmol／L）比较，TKI处理组细胞活性显著降低，组间差异具有统计学意义（F索拉菲尼＝99.34，P＜0.05；F米朵妥林＝68.37，P＜0.05），其中索拉菲尼处理组尤为明显。而TKI对HL-60细胞则无明显抑制、杀伤作用，与Con组（0 nmol／L）比较，TKI处理组细胞活性降低不明显，组间差异无统计学意义（F索拉菲尼＝1.609，P＝0.2465；F米朵妥林＝2.959，P＝0.0977）（图1C-D）。

图1 TKI处理对AML细胞系活性的影响Figure 1 The effects of TKI treatment on the activity of AML cell lines

2.2 TKI对MV4-11细胞FLT3活化和C1-TEN表达的影响

采用WB法进一步分析FLT3磷酸化水平，以评价TKI对MV4-11细胞FLT3活化的影响，探讨TKI抑制杀伤MV4-11细胞的可能机制。结果发现，经TKI作用5 h后MV4-11细胞FLT3活化显著下降（图2A-B），组间差异具有统计学意义（F＝430.6，P＜0.05）；而HL-60细胞非但FLT3活化不明显，而且FLT3表达（0 FBS RPMI-1640组、10%FBSRPMI-1640组）明显低于同样条件下的MV4-11细胞（图2A）。

有研究报道，AML细胞FLT3-ITD突变可导致某些磷酸酶表达升高。本研究中，尽管未能分析FLT3-ITD的蛋白激酶活性，但通过WB法分析了AML细胞在TKI（50 nmol／L米朵妥林或10 nmol／L索拉菲尼）作用条件下C1-TEN的表达情况。如图2A，0 FBS RPMI-1640组、10% FBS RPMI-1640组MV4-11细胞C1-TEN表达水平明显高于HL-60细胞。而且，与0 FBS RPMI-1640组、10%FBS RPMI-1640组比较，TKI组C1-TEN表达显著降低（图2A、C），差异具有统计学意义（F＝163.3，P＜0.05），同等条件下HL-60细胞则变化不明显（图2A）。

图2 TKI作用条件下AML细胞系FLT3磷酸化及C1-TEN表达情况Figure 2 FLT3 phosphorylation and C1-TEN expression in AML cell lines treated with TKI

2.3 C1-TEN抑制对MV4-11活性的影响及与TK I的协同作用

此外，本研究还探讨了C1-TEN抑制对FLT3-ITD突变AML细胞的影响。CCK-8结果显示，经C1-TEN抑制剂DHTS作用15 h后MV4-11活性显著降低（F＝1613，P＜0.05），效应呈明显剂量依赖性（图3A）。而且，DHTS能协同TKI抑制MV4-11细胞增殖（F米朵妥林＝390，P＜0.05；F索拉菲尼＝211.7，P＜0.05），但是DHTS单独作用时其抑制作用逊色于TKI单独处理组（P＜0.05，图3B-C）。然而，上述现象在HL-60细胞中并未观察到（数据未列出）。

图3 DHTS单独处理或联合TKI对MV4-11细胞活性的影响Figure 3 The effects of DHTS treating alone or combined with TKIon the activity of MV4-11 cells

2.4 DHST对MV4-11细胞的凋亡诱导作用

为探讨DHTS对MV4-11细胞的作用机制，本研究还分析了各组细胞的凋亡情况。如图4A，DHTS组caspase-3活性片段的灰度值（0.614±0.027）显著高于阴性对照（0.027±0.003），经单因素方差分析，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与caspase-3活化情况类似，DHTS处理组另一凋亡标记分子PARP活化也显著高于阴性对照（图4B）。FACS结果显示，DHTS组细胞凋亡率（45.58±0.308）较Con组（20.53±1.8）显著升高，经非配对t检验分析，差异具有统计学意义（P＜0.05，图4）。

图4 DHTS处理诱导MV4-11细胞凋亡的情况Figure 4 The apoptosis of MV4-11 cells treated by DHTS

3 讨论

AML细胞FLT3-ITD突变可引发其自身非配体依赖性、持续性活化，并与AML患者的一些不良预后密切相关［16］。一般诸如FLT3在内的一些受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）的活化受PTPase调节，因为后者具有去酪氨酸残基磷酸化功能［7，17］。作为一种报道较少的蛋白磷酸酶，虽然研究显示C1-TEN在一些实体瘤中表达下降［8］，但是它在AML细胞的表达目前尚不清楚。本研究显示AML细胞表达C1-TEN，尤其FLT3-ITD突变的AML细胞。本研究还揭示FLT3-ITD被抑制后，AML细胞C1-TEN分子表达下调，但机制有待进一步研究；而拮抗C1-TEN却能诱导细胞凋亡，杀伤FLT3-ITD突变的AML细胞。

前期预实验发现，在5份临床AML骨髓标本中，仅有1份FLT3-ITD突变AML细胞高表达C1-TEN，而其他4份FLT3-WT AML细胞C1-TEN表达不明显（数据未列出），是否提示C1-TEN在FLT3-ITD突变AML细胞高表达而在FLT3-WT AML细胞低表达？考虑到短时间内临床样本有限，本研究利用两种代表性AML细胞系用于研究AML细胞C1-TEN表达，并进一步探究FLT3-ITD与C1-TEN的调控关系。结果表明，两种TKI（米朵妥林、索拉菲尼）都具有明显抑制FLT3-ITD突变AML细胞的作用，而对FLT3-WT AML细胞的抑制效应一般，这一结果与以往报道一致［18］。同样，TKI处理组MV4-11细胞FLT3活化相比HL-60细胞也被显著抑制，再次证明FLT3-ITD活化对AML细胞成瘤性的促进作用。本研究还提示，与MV4-11细胞相比，HL-60细胞的FLT3表达明显较低，这一差异是否与这两种AML细胞系的来源背景不同有关目前还不清楚。研究已明确，FLT3-ITD能正向调节AML细胞一些下游信号通路如PI3K／Akt、janus激酶（janus kinase，JAK2）、ERK、STAT5等［19］，促进AML细胞增殖、抗凋亡、抗分化等病理过程，其中STAT5尤为重要。作为一种转录因子，STAT5是AML细胞FLT3下游信号通路中的重要靶分子，而FLT3-ITD／STAT5抗凋亡信号通路又是该类细胞的重要特征［20］。因此，调控FLT3-ITD活化是目前有关FLT3-ITD突变AML治疗研究的热点。

鉴于PTPase对FLT3在内的一些RTK的重要调节作用，本研究还进一步探讨了FLT3-ITD被抑制条件下AML细胞中与PTEN同源的蛋白磷酸酶C1-TEN的表达情况。PTEN通常被称为肿瘤抑制因子，是一种蛋白质脂质双特异性磷酸酶，包括AML在内的很多肿瘤细胞中该因子表达下降［21］。本研究发现FLT3-ITD突变AML细胞系MV4-11非但相对高表达C1-TEN，而且在抑制FLT3-ITD条件下该磷酸酶分子的表达也被下调，而经C1-TEN抑制剂DHTS作用后FLT3变化不明显。考虑到这两种TKI以及DHTS作用的相对靶向性，因此推测FLT3-ITD可能通过某种机制调控下游C1-TEN分子。这一假设或许可从其他相关研究结果初见端倪，Arora等［14］报道在MV4-11细胞FLT3-ITD能上调另一种双特异性磷酸酶PTPase的表达但无磷酸酶活性。有研究证实可能机制是FLT3-ITD通过促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生而抑制其磷酸酶活性［22］，但这一机制能否解释本研究的相关发现有待证实。

为进一步证实在促进AML细胞生长、存活等方面与FLT3-ITD的同向性，本研究还分析了MV4-11细胞分别在C1-TEN抑制剂DHTS、TKI及两者联合作用条件下的存活、增殖情况。结果表明，DHTS能有效抑制MV4-11细胞，尽管其效果不如TKI。并且在对MV4-11细胞的抑制方面，DHTS与TKI具有协同性。抑制机制方面，DHTS可能通过诱导细胞凋亡抑制MV4-11细胞，提示DHTS可能逆转FLT3-ITD突变AML细胞特征性的“FLT3-ITD／STAT5”抗凋亡通路，具体机制还需深入探讨。据此推断，蛋白磷酸酶C1-TEN不但表达于AML细胞，而且还可能是FLT3-ITD的重要下游分子，与其他相关分子共同参与AML细胞致瘤作用。

综上，本研究首次报道了AML细胞蛋白磷酸酶C1-TEN的表达情况，并揭示该分子可能作为FLT3-ITD下游重要分子共同参与AML细胞的恶性转化等病理生理过程，因而有望成为AML治疗的新靶点。但是，由于本研究为体外细胞实验，相关结论尚需在接下来的临床AML细胞样本及动物实验研究中进一步证实，并对相关机制进行深入探讨。

作者贡献声明

罗满生：提出研究思路和框架，修改论文；罗满生、赖旭旺：设计实验、统计分析数据，撰写论文；赖旭旺、邓晓玲：实验操作、数据统计和分析。

利益冲突声明

本研究未受到企业、公司等第三方资助，不存在潜在利益冲突。