甲基化转移酶样蛋白3对颞下颌关节骨关节炎滑膜巨噬细胞NLRP3炎性小体和焦亡的影响

庞春燕，方婕，祁荷栩，肖力*

（1.电子科技大学 附属医院∥四川省人民医院 口腔科，四川 成都 610072；2.口腔疾病研究国家重点实验室∥国家口腔疾病临床医学研究中心∥四川大学 华西口腔医院 正畸科，四川 成都 610041）

颞下颌关节紊乱（temporomandibular joint disorder，TMD）是一种复杂而有争议的疾病［1］。颞下颌关节骨关节炎（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA）是TMD分类中最严重的疾病之一，其特点是关节软骨基质的破坏和丧失、软骨下骨硬化、滑膜炎和骨质增生［2］。颞下颌关节是唯一由纤维软骨组成的关节。TMJOA患者的关节软骨的退行性改变一般被认为是由于关节结构功能障碍后的自我重建所致［3］。然而，目前仍难以解释导致这种疾病进展的病理生理学机制。据报道，滑膜炎是导致关节病变的主要因素，而滑膜巨噬细胞的聚集，是滑膜炎的主要病理特征［4］。研究证实，甲基转移酶样蛋白3（methyltransferaselike 3，METTL3）作为一种m6A甲基转移酶，可诱导M1巨噬细胞分化［5］。因此，本研究通过构建TMJOA大鼠模型和巨噬细胞焦亡模型，进一步探究METTL3对TMJOA滑膜巨噬细胞炎症及焦亡的影响及其机制，以期为临床防治TMJOA提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SD大鼠（雄性，SPF级，8周龄）购买于中山大学（实验动物中心东校区），许可证号SCXK（粤）2021-0029。实验动物经过四川省医学科学院∥四川省人民医院医学伦理委员会审查批准，伦理审批号：伦审（研）2022年第233号。

1.1.2 主要试剂

DMEM培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司；Lipofectamine 3000购自Thermo Fisher公司；蛋白质测定试剂盒购自碧云天公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购自美国Bio-Rad Laboratories公司；化学发光试剂购自MILLIPORE公司；METTL3过表达质粒，METTL3 siRNAs及对应的对照购自中国上海Genechem公司；苏木精和伊红（H＆E）、番红固绿和阿利新蓝染色试剂盒购自Servicebio公司；所有免疫印迹抗体购自Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 TMJOA模型构建

实验前，所有大鼠在特定的无病原体实验室中饲养7 d。动物实验按四川省医学科学院∥四川省人民医院动物护理和使用委员会的机构准则进行。在大鼠右上第1磨牙牙面粘接金属丝造成咬合创伤的办法建立TMJOA动物模型［6］。16只SD大鼠随机分为2组，对照组（n＝8）和TMJOA组（n＝8）。

1.2.2 组织学检测

颞下颌关节标本在10%中性缓冲福尔马林中固定3 d。样本在10%乙二胺四乙酸中脱钙14 d，梯度脱水进行石蜡包埋。每只大鼠3张切片。从颞下颌关节的内侧切下3个不同层次的3 μm厚的矢状面切片（相隔50μm）。对切片进行苏木精和伊红（H＆E）染色，番红固绿染色和阿利新蓝染色以观察样本的病理结构和软骨基质中蛋白多糖的变化。

1.2.3 Mankin's评分

Mankin's评分系统被用于评估颞下颌关节炎。组织学评分包含：（1）软骨结构光滑的非糜烂软骨，0分；粗糙的非糜烂软骨，1分；浅层纤维化，2分；未钙化与钙化软骨的分离，3分；（2）细胞周围基质染色正常为0分；轻微增强为1分；强烈增强为2分；（3）软骨细胞的空间排列正常为0分；弥漫性高细胞性为1分；集群性为2分；低细胞性为3分；（4）背景基质染色正常为0分；轻微增加或减少为1分；严重增加或减少为2分；无染色为3分。

1.2.4 骨关节炎软骨损伤分级（OARSI）评分

OARSI评分系统通过测量OA软骨表现的纵向（等级）和横向（阶段）的进展来评估软骨的损伤程度。总分为OA等级（0～6）分加OA阶段（0～4）分，代表对OA严重程度和范围的综合评估（0～24）分［7］。

1.2.5 颞下颌关节滑液巨噬细胞的分离

采用30 mg／kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后，对颞下颌关节区皮肤进行消毒，采用玻璃注射器吸取0.2mL的生理盐水，针尖紧贴关节凹表面进入关节上腔，注入生理盐水，经反复回抽多次后再抽回，获得的关节滑液采用Ficoll密度梯度离心法分离获得单个核细胞，采用含10%胎牛血清（OriCell®，广州赛业）的RPMI1640培养基（赛维尔，武汉）进行培养。分离获得的单个核细胞在37℃细胞培养箱中培养1 h后，去除悬浮细胞，贴壁生长的细胞即为单核巨噬细胞。采用CD45抗体（ab10558，abcam）和CD68抗体（ab283654，abcam）进行流式细胞仪检测，确定单核巨噬细胞纯度大于90%，分离获得的单核巨噬细胞进行后续研究。

1.2.6 RAW264.7细胞培养

RAW264.7巨噬细胞购自中国科学院。RAW264.7培养于添加10%胎牛血清、100 U／mL青霉素和100μg／mL链霉素的DMEM 中，置于37℃、5% CO2的培养箱中。

1.2.7 焦亡细胞模型构建

用500μng／mL脂多糖（LPS）处理RAW264.7细胞4 h，然后用5 mmol／L腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）处理细胞30 min，建立巨噬细胞焦亡细胞模型。

1.2.8 细胞转染

RAW264.7以每孔5×104个细胞的密度接种在12孔板中。24 h后，RAW264.7用Lipofectamine 3000（3 μL／孔）转染METTL3过表达质粒，METTL3 siRNAs及其对照。转染48 h后，细胞被用于后期实验。实验分5组：对照组、LPS+ATP模型组（模型组）、LPS+ATP模型转染METTL过表达对照质粒组（模型+OE-CTRL组）、LPS+ATP模型转染METTL过表达质粒组（模型+OEMETTL3组）、LPS+ATP模型转染METTL对照干扰RNA组（模型+si-CTRL组）、LPS+ATP模型转染METTL干扰RNA组（模型+si-METTL3组）。

1.2.9 ELISA分析

收集大鼠颞下颌关节滑液和各组RAW264.7培养液，离心后提取上清液。将上清液样品（50μL）加入ELISA板中，在37℃下孵育2 h。孵育后，丢弃板内容物，用0.01 mol／L三乙醇胺缓冲盐水溶液（TBS）洗板6次。随后，将底物溶液加入每个孔中。板子在黑暗中孵育20 min。最后，在每个孔中加入终止液。使用微孔板分光光度计在双波长（450 nm和570 nm）下测定光密度OD值。

1.2.10 免疫印迹

利用RIPA缓冲液提取各组细胞中的总蛋白。采用BCA试剂盒对各组蛋白质浓度进行量化，采用SDS-PAGE分离等量的蛋白质（40μg），然后转移蛋白到PVDF。PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭1 h后，PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭1 h，PVDF膜与一抗后在4℃下孵育过夜，抗体包括METTL（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶1000）；NLRP3（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶1000）；IL-18（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶1000）；IL-1β（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶1000）；Caspase-1浓度2μg／mL；Caspase3（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶2000）；p65（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶1500）；p-p65（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶1000）；IκBα（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶1000）；p-IκBα（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶1000）；GAPDH（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶5000）。清洗后，膜与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，抗体包括山羊抗兔IgG H＆L（HRP）（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶5000）；山羊抗小鼠IgG H＆L（HRP）（V抗体∶V抗体稀释液＝1∶5000）。增强型化学发光试剂孵育后，将印迹暴露在X射线胶片上15 s进行检测。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 TM JOA造模对大鼠颞下颌关节组织病理结构和关节软骨的影响

H＆E染色结果显示，对照组大鼠的颞下颌关节软骨组织完整，排列整齐，结构层次清晰，软骨表面光滑；TMJOA组大鼠的颞下颌关节软骨出现严重破坏，软骨细胞排列紊乱，炎性细胞浸润。番红固绿染色结果显示，对照组的蛋白多糖分布均匀而丰富，TMJOA组则表现出软骨退化，伴随着蛋白多糖区域和软骨细胞的减少。阿利新蓝染色也显示，对照组相比，TMJOA模型组显著变浅（图1A）。基于H＆E和番红固绿染色与阿利新蓝染色结果，发现与对照组相比，Mankin和OARSI评分在TMJOA模型组显著升高，且差异具有统计学意义（图1B和1C）。上述结果表明，通过在大鼠右上第1磨牙牙面粘接金属丝造成咬合创伤的办法成功建立了TMJOA大鼠模型。

图1 TMJOA造模对大鼠颞下颌关节组织的影响Figure 1 Effect of TMJOAmolding on histopathological structure and articular cartilage of the temporomandibular joint in rats

2.2 METTL3在模型大鼠颞下颌关节滑液巨噬细胞中的表达变化

为了进一步探究TMJOA造模影响大鼠颞下颌关节软骨组织的可能机制，首先从大鼠颞下颌关节滑液中提取巨噬细胞。显微镜下，对照和TMJOA组的巨噬细胞都呈圆形或椭圆形，并伴随短小突起（图2A）。ELISA数据表示，与对照组相比，乳酸脱氢酶（LDH）活性在TMJOA模型大鼠颞下颌关节滑液中显著升高，且差异有统计学意义（图2B）。免疫印迹结果表明，METTL3蛋白在TMJOA模型大鼠颞下颌关节滑液巨噬细胞中的表达明显高于对照组（图2C），结果说明，METTL3潜在调控颞下颌关节滑液巨噬细胞参与TMJOA。

图2 TMJOA造模后大鼠颞下颌关节滑液中LDH活性和巨噬细胞中METTL3的表达Figure 2 The LDH activity in rat temporomandibular joint synovial fluid and METTL3 expression inmacrophages

2.3 NLRP3炎性小体和焦亡相关蛋白在模型大鼠颞下颌关节滑液巨噬细胞中的表达

从对照组和TMJOA模型组大鼠颞下颌关节滑液中提取巨噬细胞后，采用免疫印迹鉴定NLRP3炎性小体和焦亡相关蛋白在两组巨噬细胞中的表达变化。结果显示，与对照组相比，NLRP3炎性小体相关蛋白（NLRP3、IL-18和IL-1β）在TMJOA模型组的表达显著升高；同时，焦亡相关蛋白（cleaved Caspase 1／pro-Caspase 1）在TMJOA模型组的表达也明显高于对照组（图3）。结果说明，大鼠颞下颌关节滑液中巨噬细胞焦亡参与TMJOA。

图3 TMJOA造模后大鼠颞下颌关节滑液巨噬细胞中NLRP3炎性小体和焦亡相关蛋白的表达Figure 3 The NLRP3 inflammasome-and pyroptosis-related protein expression levels inmacrophages from rat temporomandibular joint synovial fluid.

2.4 NLRP3炎性小体和焦亡相关蛋白在METTL3过表达或沉默的焦亡模型中巨噬细胞中的表达变化

培养巨噬细胞RAW264.7，利用LPS联合ATP诱导巨噬细胞焦亡模型，构建METTL3过表达质粒和合成siRNAs，并转染焦亡模型细胞。如图4所示，与对照组相比，NLRP3、IL-18、IL-1β、cleaved Caspase 1／pro-Caspase 1在焦亡模型组显著上调；与模型+OE-CTRL组相比，NLRP3、IL-18、IL-1β和cleaved Caspase 1／pro-Caspase 1表达在METTL3过表达的焦亡模型巨噬细胞中明显升高；与模型+si-CTRL组相比，NLRP3、IL-18、IL-1β和cleaved Caspase 1／pro-Caspase 1表达在METTL3沉默的焦亡模型巨噬细胞中明显降低，结果说明，METTL3参与调控巨噬细胞焦亡。

图4 METTL3对RAW264.7巨噬细胞焦亡模型中NLRP3炎性小体和焦亡相关蛋白表达的影响Figure 4 Effect of METTL3 on NLRP3 inflammasome-and pyroptosis-associated protein expressions in RAW264.7 macrophages pyroptosismodel

2.5 LDH 活性在METTL3过表达或沉默的焦亡模型巨噬细胞中的变化

ELISA数据显示，与对照组相比，LDH活性在焦亡模型组明显增强；与模型+OE-CTRL组相比，LDH活性在METTL3过表达的焦亡模型巨噬细胞中显著升高；与模型+si-CTRL组相比，LDH活性在METTL3沉默的焦亡模型巨噬细胞中显著降低，且差异有统计学意义（图5）。

图5 METTL3对RAW264.7巨噬细胞焦亡模型中LDH活性的影响Figure 5 Effect of METTL3 on LDH activity in RAW264.7 macrophages pyroptosismodel

2.6 IκBα和p65磷酸化在METTL3过表达或沉默的焦亡模型巨噬细胞中的变化

免疫印迹显示，与对照组相比，p-IκBα／IκBα和p-p65／p65比值在焦亡模型组显著增加；与模型+OE-CTRL组相比，p-IκBα／IκBα和p-p65／p65比值在METTL3过表达的焦亡模型巨噬细胞中明显升高；与模型+si-CTRL组相比，p-IκBα／IκBα和p-p65／p65比值在METTL3沉默的焦亡模型巨噬细胞中明显降低，且差异有统计学意义（图6）。结果说明，METTL3通过激活NF-κB信号通路促进巨噬细胞焦亡。

图6 METTL3对焦亡模型巨噬细胞中IκBα、p-IκBα、p65、p-p65蛋白表达的影响Figure 6 Effect of METTL3 on IκBα，p-IκBα，p65，and p-p65 protein expressions in pyroptosismodel macrophages

3 讨论

TMJOA是一种多因素的疾病，以软骨退化、滑膜炎和慢性疼痛为特征，是颞下颌关节最常见的疾病之一，发病率高，预后差［8］。炎症、代谢和机械压力与颞下颌关节炎密切相关［9］。目前TMJOA的机制并不完全清楚。因此，进一步探究TMJOA相关的有效分子靶点对骨关节炎的治疗至关重要。本研究结果表明，TMJOA模型大鼠颞下颌关节组织病理损伤严重，且骨关节炎加重。

滑膜由内膜层和下膜层组成。内膜层是由纤维母细胞样的滑膜细胞和巨噬细胞组成。滑膜下层由纤维结缔组织和血管组成，有巨噬细胞和淋巴细胞［10］。滑膜炎和滑膜增生的形态特征主要是巨噬细胞在内膜层增殖和聚集［11］。M1和M2巨噬细胞之间的不平衡是诱发骨关节炎（osteoarthritis，OA）炎症的关键［11］。巨噬细胞在受到炎症刺激后会发生病理变化并释放促炎分子，导致软骨的退行性变化，而导致这些变化的机制尚不清楚。本研究首先证实LDH 活性在TMJOA大鼠颞下颌关节滑液中显著升高，并进一步提取滑膜巨噬细胞，确定了NLRP3炎性小体和焦亡相关蛋白在TMJOA大鼠颞下颌关节滑液巨噬细胞中高表达。更重要的是，我们意外发现，METTL3在TMJOA大鼠颞下颌关节滑液巨噬细胞中的表达明显增加，表明METTL3在TMJOA中的重要作用。

METTL3作为最著名的m6A甲基转移酶，其功能是对m6A修饰进行可逆的转录组调节［12］。METTL3除了作为m6A甲基转移酶外，还调节mRNA翻译等生物学过程［13］。研究表明，METTL3在多个生物过程中具有至关重要的调节作用，如细胞周期、增殖、凋亡、转移、分化和炎症反应等［14］。近年来研究发现，METTL3与M1巨噬细胞分化相关［15］。例如，METTL3可通过诱导M1巨噬细胞分化增强骨髓间质干细胞成骨分化和迁移［16］；METTL3可通过STAT1甲基化促进M1巨噬细胞极化［17］；METTL3通过NF-κB减轻LPS诱导的巨噬细胞炎症反应［5］。然而，METTL3对TMJOA滑膜巨噬细胞的影响及机制并不清楚。本研究首次证实了METTL3过表达可显著增加NLRP3炎性小体和焦亡相关蛋白在LPS和ATP诱导的巨噬细胞RAW264.7中的表达，且METTL3沉默发挥相反的作用。此外，METTL3过表达也可增强焦亡模型巨噬细胞LDH的活性。

在机制探究中，本研究也初步证实，在LPS和ATP诱导的巨噬细胞RAW264.7中，METTL3过表达可明显激活IκBα和p65磷酸化，METTL3沉默可显著抑制IκBα和p65磷酸化。IκBα和p65是NF-κB信号通路的关键蛋白［18］。已有研究报道，NF-κB与TMJOA进程相关［19-21］；另有研究证实，METTL3可通过NF-κB信号通路减弱LPS诱导的巨噬细胞炎症反应［5］。

综上所述，METTL3可诱导TMJOA滑膜巨噬细胞NLRP3炎性小体和焦亡，且其调控机制可能与NF-κB信号通路的激活有关。因此，当前的研究揭示，METTL3可能成为TMJOA治疗的新靶点。

作者贡献声明

庞春燕：设计实验，动物造模，统计分析数据，撰写论文；方婕：实验操作，统计分析数据，修改论文；祁荷栩：实验操作，修改论文；肖力：提出研究思路和框架，修改论文。

利益冲突声明

本研究未受到企业、公司等第三方资助，不存在潜在利益冲突。