长链非编码RNA CCAT2与自噬相关基因Beclin 1、LC3在胃癌组织中的表达及意义

陈俊辉，石永强

(江苏省南京市溧水区人民医院 东南大学附属中大医院溧水分院消化科，江苏 溧水 211200)

胃癌是临床上最常见的消化道恶性肿瘤，我国是胃癌的高发区之一，其发病率、死亡率均较世界平均水平高2倍[1]。调查显示，我国胃癌发病率、死亡率高居恶性肿瘤的第2位、第3位，而且呈年轻化趋势。早期胃癌经根治性治疗后的5年生存率可高于90%，但由于胃癌早期无特异性症状、胃镜常规体检未普及、相关知识缺乏等诸多因素，大于80%胃癌患者确诊时已达进展期，预后极差[2]。因此，积极探索胃癌生物学特性及其分子机制，并寻找可能的评价胃癌诊断及预后，或潜在的治疗靶点的分子标志物具有重要临床价值。长链非编码RNA( long non-coding RNA，lnc RNA)指长度超过200 nt的非编码RNA，可以在肿瘤发生、发展中起到重要作用，是肿瘤领域的研究热点之一。研究显示，Lnc RNA 在胃癌的生物学活性中扮演多重角色，可能成为评价胃癌诊断及预后的标志物或治疗的靶点[3]。Lnc RNA结肠癌相关转录因子2(colon cancer associated transcript 2,CCAT2)在多种恶性肿瘤中异常高表达，被认为是一种促癌因子[4]。研究发现，lncRNA 可调控自噬而影响疾病进程[5]。目前，CCAT2与胃癌自噬的相关文献较少，故本研究采用实时荧光定量 PCR( Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)检测胃癌组织中CCAT2、自噬相关基因Beclin1和微管相关蛋白轻链3(LC3)mRNA的表达水平，并探讨 CCAT2 与胃癌临床特征及自噬的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料：收集本院2016年1月～2018年12月在南京市溧水区人民医院诊治的胃癌患者40例。纳入标准：经病理诊断为胃癌，采用美国癌症联合委员会( AJCC)临床分期标准[6]：年龄30～70岁，男女不限；术前均未接受放化疗等抗肿瘤治疗；临床相关资料完整；知情同意。排除标准：胃良性肿瘤；合并其他器官恶性肿瘤。其中男24例，女16例，平均年龄65.42岁；TNM 分期:Ⅰ期5例，Ⅱ期13例，Ⅲ期19例，Ⅳ期3例；分化程度：低分化15例，高中分化25例；淋巴结转移12例。本研究经医学伦理委员会批准。

1.2标本采集：将手术所取癌组织及癌旁正常组织(距肿瘤边缘>5 cm)加入RNA- later保护液，-80℃冰箱冻存备检。

1.3qRT-PCR法检测CCAT2、Beclin1、LC3mRNA：取1 mm3组织标本，剪碎并加入裂解液研磨，采用Trizol法提取总RNA。离心取上清液，采用OD260/280分光光度法观察每个RNA 样品的纯度。取1 μg总RNA采用 cDNA 逆转录试剂盒完成cDNA合成。以cDNA为模板，CCAT2 引物参考文献[7]进行设计，Beclin1和LC3引物参考文献[8]进行设计，以GAPDH 为内参照。采用两步法标准PCR扩增程序： 第一步即预变性，95℃ 30 s，1个循环;第二步即PCR反应，95℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，40个循环。每个样品设3个复孔，采用 2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达量。

2 结果

2.1胃癌组织中的CCAT2、Beclin1、LC3的表达情况：胃癌组织中CCAT2 mRNA 2.84±0.72显著高于癌旁正常组织的1.63±0.51，差异有统计学意义(t=，P=0.000)；胃癌组织中Beclin1 mRNA(0.28±0.02)显著低于癌旁正常组织1.47±0.13，差异有统计学意义(t=，P=0.000)；胃癌组织中LC3 mRNA 0.47±0.05，显著低于癌旁正常组织的1.36±1.11，差异有统计学意义(t=，P=0.000)。

2.2CCAT2、Beclin1、LC3的表达与胃癌临床病理特征的相关性：胃癌组织中的CCAT2 表达与胃癌直径大小、TNM分期、淋巴结转移明显相关(P<0.05)，而与年龄、性别、胃癌分化程度、侵犯深度等因素无关(P>0.05)。Beclin1表达与胃癌直径大小、TNM分期、淋巴结转移明显相关(P<0.05)，而与年龄、性别、胃癌分化程度、侵犯深度等因素无关(P>0.05)。LC3表达与胃癌直径大小、TNM分期、分化程度明显相关(P<0.05)，与年龄、性别、淋巴结转移、侵犯深度等因素无关(P>0.05)。见表1。

表1 胃癌组织中CCAT2、Beclin1、LC3表达和临床病理特征的关系

2.3胃癌组织中CCAT2、Beclin1、LC3表达的相关性分析：胃癌组的CCAT2水平与Beclin1、LC3水平呈明显负相关，差异具有统计学意义(r=-0.674，0.513，均P<0.05)。

3 讨论

CCAT2作为一种新的致癌LncRNA，该基因定位于富含调控元件标记物的高度保守的8q24基因组区域；最初被发现在结肠癌中呈现高表达，而在正常结肠组织中呈低表达；后越来越多的研究证实，CCAT2在非小细胞肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、食管癌、肝癌等多种肿瘤组织中存在异常高表达，并与肿瘤进展及不良预后有关，提示CCAT2可能作为一种新的肿瘤标志物[9-13]。 研究发现，敲除CCAT2基因可诱导癌细胞凋亡，抑制癌细胞增殖及侵袭，提示CCAT2可能作为一种新的肿瘤治疗靶点[14]。而国内关于CCAT2在胃癌中表达情况的报道不多，故探讨CCAT2 在胃癌中表达情况及与临床特征的相关性具有的重要临床价值。

本研究结果显示，CCAT2胃癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织。有研究显示，CCAT2在胃癌患者血清中呈高表达[15]。上述结果提示，CCAT2 作为致癌因素在胃癌中发挥重要作用，可能成为一种新的胃癌肿瘤标志物。本研究结果显示，CCAT2 表达水平与胃癌直径大小、TNM分期、淋巴结转移有相关性，而与年龄、性别、胃癌分化程度、侵犯深度等因素无关。与余招焱等研究结果一致[16]。上述结果提示，CCAT2的高表达可能促进胃癌细胞的增殖、淋巴结转移的发生，可能成为一种新的胃癌治疗靶点。

自噬是肿瘤细胞的发生程序性死亡的一种主要形式，也是目前肿瘤相关基础及临床研究的热点之一[17]。Beclin1作为自噬核心复合物的重要组成部分，在维持自噬活性中起到重要作用，是调节肿瘤自噬活性的关键因素之一[18]。研究发现，Beclin1能通过激活自噬过程从而抑制肿瘤的发生；反之，干扰Beclin1的生物活性使得肿瘤的自噬水平降低[19]。LC3作为编码自噬相关蛋白的重要基因之一，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，参与自噬体的形成，是公认的自噬体特异性标记蛋白[20]。所以检测Beclin1、LC3的表达水平可反映自噬水平。

本研究结果显示，胃癌组织中Beclin1、LC3呈低表达，反映胃癌中自噬水平降低，与罗小月等研究结果一致[21]。本研究结果显示，Beclin1、LC3表达水平均与胃癌直径大小、TNM分期有关，提示自噬水平降低可能促进肿瘤进展。相关分析结果显示，CCAT2表达水平与Beclin1、LC3表达水平呈负相关关系，提示CCAT2可能通过降低胃癌细胞自噬活性，进而促进胃癌细胞的增殖及转移。自噬对胃癌细胞起着促进和抑制的双重作用，在特定情况下自噬导致胃癌细胞存活亦或死亡仍存在争议[22]。目前关于CCAT2 上游及下游基因的调控及具体致癌机制尚未完全阐明。研究显示，CCAT2可能通过 PTEN/PI3K/AKT、Wnt /β-catenin等信号通路发挥致癌作用[23]。而在不同影响因素条件下，不同信号通路作用下，CCAT2调控自噬的过程并不十分清楚，还有许多细节需要进一步研究。

综上所述，CCAT2在胃癌组织中表达异常增高，并与胃癌直径大小、TNM分期、淋巴结转移相关；CCAT2与Beclin1、LC3呈负相关关系，提示CCAT2 在胃癌中发挥促癌作用，其机制可能与抑制胃癌细胞自噬有关。