不同产地苦参中生物碱类含量测定及指纹图谱研究

王昊天，叶世芸*，殷少文，郑立肯，鉴志刚

(1.贵州中医药大学 药学院，贵州 贵阳 550002；2.贵阳市第三人民医院 科教科，贵州 贵阳 550006)

苦参是豆科植物苦参(SophoraflavescensAit.)的干燥根[1]。自古以来，苦参在我国就多有应用，如《本草纲目》《滇南本草》《神农本草经》等对其功效均有记载。苦参性寒，味苦，归心、肝、胃、大肠、膀胱经，具有清热燥湿、杀虫利尿之功效，可用于治疗阴肿阴痒、湿疹、热痢便血、皮肤瘙痒及外治滴虫性阴道炎等病症，尤宜治疗妇科疾病[1-4]。苦参作为常用中药，在我国分布广泛，如河南、湖北、河北、内蒙古等地均是其产区[2，5]。苦参含有黄酮、生物碱、木脂素、萜类、微量元素等多种成分[2，4-8]，具有抗炎、调节免疫、镇痛、抗心律失常、抗癌、抑菌等药理活性[5-6]。其中，生物碱类及黄酮类成分在苦参中占比较大且为主要的活性成分[2，4]，是现今研究报道的重点。苦参中生物碱类成分更是以苦参碱及氧化苦参碱为主，因此自1963年版《中华人民共和国药典》就将苦参碱及氧化苦参碱作为苦参的指标性成分，2005年版《中华人民共和国药典》加入HPLC测定含量也是将这两种生物碱作为指标成分，至2020年版《中华人民共和国药典》未改变。随着中药产业的发展及研究的深入，仅以苦参碱及氧化苦参碱作为苦参含量测定的指标已无法满足对苦参的质量控制(如与山豆根的区分)。因此，关于苦参中黄酮类成分、其他生物碱成分及将其作为指标成分的研究报道日渐增多[4，9-11]。关于苦参中生物碱的含量测定及指纹图谱的研究已有报道，而将两者结合同时考察的研究较为鲜见。因此，本实验以4种生物碱作为指标性成分，建立HPLC的含量测定方法，测定不同产地苦参中生物碱类化合物的含量，并建立指纹图谱，旨在比较不同产地苦参质量，为完善苦参质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(型号：1260 HPLC，厂商：Agilent)；HC-S4高速多功能粉碎机(永康市天琪盛世贸有限公司)；YQ-1000A超声清洗仪(上海易净超声波仪器有限公司)；AE240天平(上海梅特勒有限公司)；药典筛(绍兴市上虞张兴沙筛厂)；Welch Ultimate XB-NH2色谱柱(规格：4.6 mm×250 mm，5 μm，厂商：上海Welch公司)。

1.2 试剂与材料

31批苦参产于内蒙古、云南、贵州、陕西等地，均为市售药材，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为豆科植物苦参(SophoraflavescensAit.)的干燥根，产地信息见表1；槐定碱对照品(170425)、苦参碱对照品(170512)、槐果碱对照品(161113)、氧化苦参碱对照品(170428)均购于北京世纪奥科生物技术有限公司；氨水(分析纯)、无水乙醇(分析纯)、无水乙醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)均购于天津市科密欧化学试剂有限公司；三氯甲烷(分析纯，厂商：上海试剂四赫维化工有限公司)；磷酸(分析纯，厂商：成都市科龙化工试剂厂)；水(娃哈哈纯净水，厂商：娃哈哈饮料有限公司)。

表1 31批苦参样品

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Welch Ultimate XB-NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相乙腈-无水乙醇-3%磷酸(85∶7.5∶7.5)，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长220 nm，进样量为10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 取对照品槐定碱、苦参碱、槐果碱、氧化苦参碱适量，精密称定，加入乙腈-无水乙醇(85∶15)溶解定容，分别制成含槐定碱3.74 mg/mL、苦参碱3.77 mg/mL、槐果碱3.61 mg/mL、氧化苦参碱3.98 mg/mL的对照品母溶液。自各对照品溶液中取2 mL，置于10 mL容量瓶中，加入乙腈-无水乙醇(85∶15)定容，制成混合对照品溶液(含槐定碱0.748 mg/mL、苦参碱0.754 mg/mL、槐果碱0.722 mg/mL、氧化苦参碱0.796 mg/mL)，摇匀，备用。根据实验所需，可稀释成不同浓度的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取苦参粉末约0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加入氨水1.5 mL和三氯甲烷25 mL，称定，超声30 min，冷却至室温，补重，滤过，取续滤液5 mL，水浴蒸干，残渣加乙腈-无水乙醇(85∶15)溶解，转移至10 mL容量瓶，定容，用0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系考察 配制不同浓度的混合对照品溶液，测定，以浓度对峰面积进行线性回归处理，得到4种生物碱线性方程，见表2、表3、表4、表5。

表2 槐定碱线性方程

表3 苦参碱线性方程

表4 槐果碱线性方程

表5 氧化苦参碱线性方程

2.3.2 精密度试验 取内蒙古3苦参样品，称取苦参粉末约0.5 g，制成供试品溶液，连续进样6次，分别测定。所得4种生物碱峰面积的RSD值为0.88%～2.69%，该仪器和方法精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取内蒙古3苦参样品，称取苦参粉末约0.5 g，制成供试品溶液，分别于0、1、2、3、5、8 h测定。测得4种生物碱峰面积的RSD值为0.47%～1.88%，样品在8 h内稳定。

2.3.4 重复性试验 取内蒙古2苦参样品，称取苦参粉末6份，每份约0.5 g，制成供试品溶液并测定。测得4种生物碱峰面积的RSD值为1.09%～2.70%，该方法重复性好。

2.3.5 加样回收率试验 取已知含量的苦参药材(槐定碱、苦参碱、槐果碱、氧化苦参碱含量分别为0.129%、0.984%、0.151%、2.696%)粉末9份，每份约0.25 g，分别加入对照品溶液后(每种对照品溶液的加入量设定3个水平，每水平3份)，制成供试品溶液并分别测定。测得槐定碱、苦参碱、槐果碱、氧化苦参碱的回收率分别为95.08%～104.19%、95.46%～101.15%、95.15%～104.80%、97.28%～104.80%，平均回收率分别为98.23%～103.50%、96.68%～99.26%、97.45%～101.49%、99.58%～102.95%，回收率的RSD值分别为0.92%～2.78%、0.81%～2.93%、2.73%～2.99%、1.69%～2.76%，表明该方法回收率良好。

2.4 多批次苦参饮片中生物碱类成分含量测定

2.4.1 31批苦参样品4种生物碱含量测定 取31批苦参样品，制成供试品溶液，进行测定，记录峰面积并计算各产地苦参中4种生物碱的含量，结果见表6。

表6 不同产地苦参中槐定碱、苦参碱、槐果碱、氧化苦参碱的含量

2.4.2 31批苦参样品聚类分析 使用SPSS 26.0软件对31批苦参样品进行系统聚类分析，以4种生物碱的含量为变量，以瓦尔德法采用平均欧氏距离(d)测定相似度，聚类分析结果见图1。由图1可知，当d=15时，31批苦参样品可聚为两类，一类为3、23、5、26、16、7、11、22、30，另一类为20、28、10、29、4、6、12、31、2、19、21、24、27、1、15、8、14、18、9、25、17、13；当d=10时，后一类又可聚为两类，即20、28、10、29、4、6、12、31、2、19、21、24、27聚为一类，1、15、8、14、18、9、25、17、13聚为另一类；当d=5时，13号又独自聚为一类，即来自贵州2的苦参。

图1 31批苦参样品的聚类分析

2.5 苦参HPLC指纹图谱方法学考察

2.5.1 精密度试验 取内蒙古3苦参样品，制成供试品溶液，连续进样6次，分别测定，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3.00%，该仪器和方法精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 取内蒙古3苦参样品，制成供试品溶液，分别于0、1、2、3、5、8 h测定，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3.00%，样品在8 h内稳定。

2.5.3 重复性试验 取同一产地批次苦参样品6份，每份约0.5 g，制成供试品溶液并测定，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3.00%，该方法重复性好。

2.6 31批苦参样品指纹图谱建立及相似度评价

将31批苦参样品制成供试品溶液并测定，记录色谱图。根据31批苦参样品的测定结果，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会，2004A版)，建立31批苦参样品指纹图谱，以S1为参照图谱，采用多点校正并进行匹配，生成对照指纹图谱，共有峰5个，见图2，与混合对照品溶液色谱图的相对保留时间进行比较并指认色谱峰。如图3所示，可知1号峰为槐果碱，2号峰为苦参碱，4号峰为槐定碱，5号峰为氧化苦参碱。通过软件对指纹图谱的相似度进行计算，可知31批苦参样品指纹图谱的相似度在0.73～0.99之间。

图2 31批苦参样品指纹图谱

注：A.混合对照品溶液；B.空白溶剂；1.槐果碱；2.苦参碱；4.槐定碱；5.氧化苦参碱。

3 讨论

3.1 检测波长选择及对供试品溶液制备方法考察

在确定色谱条件时，通过对全波段扫描，发现苦参总碱类化合物在220 nm处有最大吸收，所以选用220 nm作为检测波长。根据文献和预实验发现，在供试品溶液制备中，提取溶剂体积、超声时间对含量影响较大。因此，用单因素考察法分别对三氯甲烷体积(15 mL、20 mL、25 mL、30 mL、35 mL)、氨水体积(0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL)、超声时间(20 min、25 min、30 min、35 min、40 min)进行了考察，又用响应面优化法分别对三氯甲烷体积(20 mL、25 mL、30 mL)、氨水体积(0.5 mL、1.5 mL、2.5 mL)、超声时间(20 min、25 min、30 min)的选择进行了优化，最终确定三氯甲烷体积25 mL、氨水体积1.5 mL、超声时间30 min为最优方案。

3.2 结果分析

31批苦参样品指纹图谱的相似度在0.73～0.99之间，引起相似度低于0.8的苦参样品产自于贵州，其余苦参样品间的相似度良好。但根据4种生物碱含量，经系统聚类分析，当d(平均欧氏距离)=10时，可将31批苦参样品聚分为3类，3、23、5、26、16、7、11、22、30为第一类，20、28、10、29、4、6、12、31、2、19、21、24、27为第二类，1、15、8、14、18、9、25、17、13为第三类。这表明不同产地的苦参样品间虽有着高度一致的化学成分，但各生物碱的含量各有不同。根据含量测定结果，31批苦参样品中苦参碱和氧化苦参碱的总量均大于1.2%，符合2020年版《中华人民共和国药典》的要求。以苦参碱和氧化苦参碱的总量作为依据，总体上第一类的苦参样品最佳，第二类次之，第三类最差。其中，产于贵州2的苦参，不论是苦参碱和氧化苦参碱的总量，还是4种生物碱的总量，均排在最后，质量最差。这与系统聚类分析中，当d=5时，来自贵州2的苦参独自聚为一类的结果相符。但来自贵州3苦参中生物碱的含量较高，表明可能贵州省不同批次、不同地区间苦参的质量也存在着差异。产于云南、四川、湖南等地的苦参普遍生物碱含量较高，宜于临床优先选用。

由含量测定结果可知，4种生物碱在苦参中的含量趋势由高到低依次为氧化苦参碱、苦参碱、槐定碱、槐果碱，且苦参碱和氧化苦参碱的总量在4种生物碱的总量中占比较高，而这4种生物碱均为苦参的药理活性成分。氧化苦参碱具有抗肿瘤、抗炎镇痛、调节免疫等活性[5-6，12-14]。苦参碱具有抗肝损伤、抗心律失常、抗纤维化、镇静等诸多活性[5-6，12，15-18]。随着苦参研究的深入，槐定碱及槐果碱的药理活性研究也有一定进展。除与氧化苦参碱、苦参碱同样具有抗菌、抗病毒、抗炎、免疫调节等活性，槐果碱还有抗腹泻、保肺、抗结肠炎、改善心肌肥厚以及抗柯萨奇病毒的作用[5-6，19-20]。而槐定碱则抗炎作用较强，可应对各种急慢性炎症，且能抑制细胞免疫及体液免疫[21]。综上，不同产地苦参中各生物碱含量的差异可能会造成临床疗效的差异，应将含量和药理活性综合考虑，选择指标成分评价苦参的质量。本实验以4种生物碱作为指标成分，相较以往，补充了槐果碱、槐定碱这两种苦参中的活性成分，使苦参质量评价更加全面、可靠。经方法学考察，本实验所用方法方便、可行，可为进一步完善苦参质量控制提供参考。