基于SSR标记的鲌鲂“先锋2号”、团头鲂及黑尾近红鲌的群体遗传分析

孙艳红，马 浩，魏辉杰，王贵英，陈 见，祝东梅，李 佩，李 清

(1.武汉市农业科学院水产研究所，武汉 430207；2.华中农业大学，武汉 430070;3.武汉先锋水产科技有限公司，武汉 430207)

鲂、鲌均隶属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)鲌亚科(Cultrinae)。团头鲂()是鲂类中重要的组成部分，是我国重要的淡水经济鱼类，广泛分布于各流域湖泊，因其食性广、易捕捞、生长快、肉质细嫩而深受喜爱；黑尾近红鲌()是长江上游特有经济鱼类，其人工养殖成本低、性情温驯、易捕捞、易活鱼上市。本研究科研团队将经选育的体型好、生长快的4代的团头鲂(♀)与经选育的4代的抗应激、反应温顺黑尾近红鲌()进行杂交，再经过4代以上的选育获得了体型与团头鲂相近，生长快、抗应激能力强的鲌鲂“先锋2号”，已于2019年被全国水产原良种委员会审定为新品种。ZHU等已经报道过鲌鲂“先锋2号”的线粒体序列，但是对于亲本和子代之间的亲缘关系以及遗传多样性分析还未见报道。

遗传多样性是种群或者群体长期生存和发展中遗传变异的直接体现，因此探究鱼类的遗传多样性可以为鱼类的育种工作提供相应的理论指导。微卫星(microsatellite)也称简单重复序列(simple sequence repeats,SSRs)，由串联排列的1～6 bp简单序列重复组成，是广泛分布在真核生物基因组中的一种中度重复序列。目前为止，微卫星标记由于具有高突变率、共显性、在基因组中广泛均匀分布、稳定易检测等优点大多被应用到鱼类群体遗传的研究和遗传图谱绘制。在鱼类杂交后代的遗传分析中也都普遍使用微卫星技术，已有学者对黄颡鱼()(♀)×瓦氏黄颡鱼()()、尼罗罗非鱼()(♀)×萨罗罗非鱼()()、团头鲂(♀)×翘嘴鲌()()等进行亲本与子代的分析。

本实验利用筛选的11个微卫星位点对鲌鲂“先锋2号”、团头鲂及黑尾近红鲌群体的遗传特性以及亲缘关系进行了分析，旨在为鲌亚科鱼类的合理开发利用、下一步的选育工作以及种质资源保护提供一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

团头鲂群体引自湖北省梁子湖野生群体，黑尾近红鲌群体引自长江上游野生群体，两者均经过了武汉市农科院水产所和武汉先锋水产科技有限公司(先锋公司)4代选育，将选育的团头鲂(♀)与选育的黑尾近红鲌()进行杂交，再经过4代选育获得了体型与团头鲂相近，生长快、抗应激能力强且在肉质方面上具有优势的鲌鲂“先锋2号”。三个群体均在先锋公司基地进行人工养殖。三个群体各取30尾，分别剪尾鳍保存于无水乙醇中，带回实验室于4 ℃冰箱中备用。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA的提取与检测

使用酚氯仿分别提取鲌鲂“先锋2号”、团头鲂、黑尾近红鲌三个群体共90个样本的DNA。基因组DNA质量通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用紫外分光光度计进行DNA浓度与纯度的检测，合格后稀释至100 ng/μL，置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 荧光标记的微卫星引物

根据SUN等发表的黑尾近红鲌微卫星引物，从90尾样本中随机挑选5尾团头鲂、5尾鲌鲂“先锋2号”、5尾黑尾近红鲌的基因组DNA为模板，PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，聚丙烯凝胶电泳检测后银染，筛选出多态性好以及能够稳定扩增的引物，用于三个群体的遗传分析。

表1 微卫星荧光引物和位点特征

1.2.3 PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测及SSR分型

通过PCR扩增使11对荧光引物在鲌鲂“先锋2号”、团头鲂、黑尾近红鲌三个群体总共90个样本中进行扩增，PCR反应总体系20 μL，包括Premix TagVersion 2.0 (Takara) 10 μL，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1.5 μL，ddHO 6.5 μL。PCR扩增：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火温度30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增后的产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其存在性后送由上海生工生物工程有限公司用ABI PRISM 3730测序仪进行等位基因分型。

1.2.4 数据分析

采用Genemarker录入每个微卫星位点各个个体的等位基因数据；Popgene v1.32和Cervus v3.03计算了每个位点的平均等位基因数(number of alleles,)、有效等位基因数目(number of effective alleles,)、观测杂合度(Observed heterozygosit,)、期望杂合度(Expected_heterozygosity,)、多态性信息含量(Polymorphysm_information_content,)和Nei’s遗传距离；Convert131进行转换格式类型。采用软件Poptree V2和MEGA X建立群体遗传关系的聚类树；PCoA-GenALEx v6.5基于遗传距离来分析群体间的遗传关系。

2 结果分析

2.1 微卫星多态性引物的筛选

对所选46对微卫星引物进行筛选工作，初步筛选出11对符合预期的微卫星引物，按照其扩增片段的大小进行组合，组合内进行三种荧光染料(6-FAM,HEX,ROX)分别标记，荧光标记引物见表1，荧光引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

2.2 遗传多样性分析

将11对引物在鲌鲂“先锋2号”、团头鲂、黑尾近红鲌三个群体分别进行扩增情况统计分析(表2)。结果显示，团头鲂群体的在2～6之间，平均为4.182，在1.133～3.122之间，平均为2.482，在0.063～1.000之间，在0.121～0.733之间，值为0.508，6个位点极显著或显著偏离哈迪-温伯格平衡；鲌鲂“先锋2号”群体在2～8之间，平均为4.273，在1.827～6.564之间，平均为3.080，在0.067～0.867之间，在0.471～0.875之间，值为0.572，1个位点显著偏离哈迪-温伯格平衡；黑尾近红鲌群体在2～15之间，平均为4.273，在1.210～11.842之间，平均为2.803，在0.063～0.933之间，在0.179～0.947之间，值为0.414，2个位点显著偏离哈迪-温伯格平衡。三个群体共90个个体在11个微卫星位点上共扩增出81个等位基因。其中在3～20的范围内，的范围为2.084～9.400，均值分别是7.364和3.862。的在0.188～0.830之间，均值为0.537。的在0.528～0.930之间，均值为0.696。在群体水平上进行统计分析，11个位点在三个群体中的多态百分比均为100%。黑尾近红鲌群体的,和三项指标均小于其他两个群体。

表2 三种鱼11个微卫星位点的遗传多样性参数

2.3 群体间的遗传距离与遗传相似度

三个群体间Nei的遗传相似度和遗传距离见表3。鲌鲂“先锋2号”和团头鲂的遗传相似度(0.762 7)高于鲌鲂“先锋2号”和黑尾近红鲌的遗传相似度(0.583 8)。鲌鲂“先锋2号”和团头鲂的遗传距离(0.270 9)小于鲌鲂“先锋2号”和黑尾近红鲌的遗传距离(0.538 1)，表明杂交鲌鲂“先锋2号”与母本团头鲂的亲缘关系更近，遗传上更偏向于母本，这与杂交选育过程中表现出来的形态学分析结果相一致，表明团头鲂对杂交子代的贡献率大于父本黑尾近红鲌。

表3 三种鱼间Nei的遗传相似度(对角线上)和遗传距离(对角线下)

2.4 群体间的遗传结构与亲缘关系

2.4.1 聚类分析

基于遗传距离运用UPGMA法对三个群体进行聚类分析(图1)。结果表明，黑尾近红鲌群体与其他两个群体分离，单独形成一支，团头鲂群体和鲌鲂“先锋2号”群体两个群体聚成一支。

图1 基于遗传距离建立的UPGMA聚类树

2.4.2 分子变异分析

通过对三个群体的AMOVA分析结果表明，种群间的遗传变异占27.09%，种群内的遗传变异占72.91%(表4)。群体内的遗传变异大于群体间，总体上整个群体发生了显著的遗传分化[遗传固定系数(st)=0.271，<0.000 1]。

表4 三个群体的分子方差变异分析

2.4.3 PCoA主坐标分析

基于个体间遗传距离对三个群体90个个体进行PCoA主坐标分析(图2)，可以明显发现团头鲂群体与鲌鲂“先锋2号”群体更为相似聚集在一起，而黑尾近红鲌群体中个体相距较远而单独聚类。

图2 3个群体基于个体间遗传距离的PCoA主坐标分析Fig.2 Principal coordinate analysis (PCoA) of pairwise distances between individuals of three populationsTTF：团头鲂；XF2：鲌鲂“先锋2号”；HW：黑尾近红鲌

3 讨论

3.1 群体遗传多样性分析

研究表明，微卫星侧翼序列在亲缘关系较近的群体间相对保守，同时有部分微卫星在亲缘关系较远的分类群体间也具有一定的保守性，因此使得SSR分子标记具有较高的通用性，可在不同种群之间快速、有效地扩增，且群体间亲缘关系越近，跨种扩增的可能性越强。基于此原理，大黄鱼、鲤、鲟鱼和团头鲂的微卫星引物都能在近缘物种中有效扩增，并应用于遗传分析研究。在本研究中，在黑尾近红鲌基因组和转录组中开发的11对中高多态性的微卫星引物在不同种的鲌鲂“先锋2号”与团头鲂群体中均能进行有效扩增，但是在团头鲂群体中偏离哈迪-温伯格平衡的位点数较多，可能与非同源跨种应用，等位基因数偏少有关。

目前，国内关于鲂属和鲌属的育种工作主要集中在选择育种和杂交育种两个方面。群体的遗传多样性能体现出物种是否能够较快适应环境、维持生命并产生突变进化的能力，其主要表现在有效等位基因数的丰富和均匀程度、遗传杂合度的大小和多态信息含量3个方面。等位基因越多，遗传杂合度数值越大，多态信息含量数值越高，则证明群体遗传变异越高，更能适应自然环境变化。杂交后代的等位基因和杂合度一般都高于双亲，这也是形成杂种优势的重要遗传物质基础之一。本研究中通过11对微卫星引物检测到鲌鲂“先锋2号”的平均有效等位基因(3.080)大于母本团头鲂(2.482)与父本黑尾近红鲌(2.803)，鲌鲂“先锋2号”的平均观测杂合度(0.507)小于母本团头鲂(0.712)大于父本黑尾近红鲌(0.380)，鲌鲂“先锋2号”的多态信息含量(0.572)均高于父本黑尾近红鲌(0.414)与母本团头鲂(0.508)，多态信息含量大于5时为高度多态，表明杂交鲌鲂“先锋2号”的遗传变异程度较团头鲂、黑尾近红鲌群体高，更能适应自然环境的变化，更易存活。这些研究结果同以往许多研究报道都有一致性，如李景芬等研究黄颡鱼(♀)×瓦氏黄颡鱼()得出的杂种一代基因变异程度比双亲高，DNA多态性丰富。王宏玉等研究的黄颡鱼(♀)×长吻鮠()杂交子代多态性信息含量、杂合度以及等位基因数均比双亲高。这些研究结果都体现出杂交子代较双亲的遗传多样性有所增加，具有一定的杂交优势,有较大的培育潜力。

3.2 亲缘关系分析

遗传距离与遗传相似度常用于群体的亲缘关系分析。杂交亲本间遗传差异越大，亲缘关系越远，其后代杂种优势越明显。李思发等基于SSR标记对五种罗非鱼群体进行了遗传距离分析，构建的NJ聚类树以及UPGMA聚类树，结果表明，其中两个杂交种在遗传上与母本遗传距离较近；王俊基于SSR标记对哲罗鲑()、细鳞鲑()及杂交子一代进行亲缘关系分析，结果表明子一代与母本细鳞鲑的遗传距离(0.315 0)小于子一代与父本哲罗鲑之间的遗传距离(0.395 3)，同时与母本的遗传相似系数(0.729 8)大于父本(0.673 5)，子一代与母本亲缘关系更近；朱树人开发10对微卫星引物对乌鳢()、斑鳢()及杂交F1的进行了群体遗传多样性分析，并利用三种鱼之间的遗传距离进行了聚类分析，发现杂交F1的遗传特性偏向母本斑鳢。而王宏玉等研究的黄颡鱼(♀)×长吻鮠()杂交子代与父本的亲缘关系和遗传距离更近，以及陈见等研究的翘嘴鲌(♀)与黑尾近红鲌()杂交子代也是与父本遗传差异小于与母本的遗传差异，与父本的亲缘关系较近。这些研究结果均表明杂交双亲的遗传物质对子代的贡献存在不对等现象。

本研究采用NJ聚类以及PCoA主坐标分析来探讨团头鲂、鲌鲂“先锋2号”、黑尾近红鲌三种鱼之间的遗传亲缘关系。从NJ聚类分析能明显看出鲌鲂“先锋2号”与母本团头鲂具有更近的亲缘关系，而与父本黑尾近红鲌相距较远。从PCoA主坐标分析方面表明鲌鲂“先锋2号”各个个体之间与团头鲂各个个体之间具有较小的遗传差异。这与杂交选育过程中表现出来的形态分析研究结果一致，表明团头鲂对杂交子代的贡献率大于黑尾近红鲌。

以上结果可能由于在选育过程中，杂交子代的选择以形态学上接近母本团头鲂的个体为主，因此遗传上，鲌鲂“先锋2号”更接近母本团头鲂，与父本黑尾近红鲌相距较远。一般情况下，在鱼类进行杂交时，异源精子可能只对卵子起到刺激作用，父本有部分遗传物质可能向子代传递。同时，人工操作和环境因素对基因交流、亲本向子代传递遗传物质的过程都会产生影响。虽然鲌鲂“先锋2号”更偏向于母本，但同时也具备了父本黑尾近红鲌的遗传物质，因此后代较双亲更有优势。通过养殖对比试验发现其生长速度与团头鲂接近，但在起捕率和耐运输方面优于团头鲂