胃癌组织中HEG1、KRIT1的表达及其临床意义

方玲，夏永欣，张向东

(南阳市中心医院 消化内科二病区，河南 南阳 473000)

胃癌是最常见的癌症类型，其早期阶段症状隐匿且具有非特异性，就诊时多数患者已处于中晚期[1]。手术切除是胃癌的有效治疗方法，且随着近年来化疗的进展，患者无进展生存期和总生存率有所提高，但预后仍然较差，晚期患者5年生存率仅为20%左右[2]。因此，寻找可准确预测胃癌患者预后的指标有积极意义。具有表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)样结构域的心脏发育蛋白1(heart development protein with EGF- like domains 1，HEG1)是一种跨膜蛋白。研究发现，HEG1能促进间皮瘤细胞的增殖和存活，可作为新颖且精确的恶性间皮瘤鉴定标志物，用于恶性间皮瘤的早期诊断和治疗[3]。Krev相互作用捕获蛋白1(Krev interaction trapped protein 1,KRIT1)具有锚蛋白重复序列和一个FERM结构域，其参与脑海绵状血管瘤的发生发展，敲低KRIT1能够促进锚定独立的肿瘤细胞生长[4]。HEG1、KRIT1均可影响癌症的疾病进展，且HEG1能直接结合KRIT1，调节和维持内皮连接的完整性[5]。但两者表达与胃癌的关系目前尚不清楚。本研究通过分析胃癌组织中HEG1、KRIT1蛋白的表达及其临床意义，为胃癌预后标志物的寻找提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2014年9月至2016年9月收治的胃癌患者85例作为研究对象，其中男59例，女26例，年龄32～79岁，平均(60.74±12.35)岁。纳入标准：(1) 病 理检查确诊为胃癌；(2) 临床资料完整。排除标准：(1) 合并其它恶性肿瘤；(2) 合并机体免疫性疾病；(3) 无法配合研究。所有研究对象或其直系亲属签署知情同意书，且经我院伦理委员会审核、批准后实施(伦理批号20140817)。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集 患者均行手术治疗，在术中收集患者胃癌组织85例以及癌旁正常黏膜组织(距病灶≥2 cm 的组织)57例，经石蜡包埋后保存待测。

1.2.2 免疫组化法检测HEG1、KRIT1蛋白表达 将石蜡包埋后的组织标本制备成4 μm的连续切片，经常规烤片、脱蜡、酒精梯度脱水、抗原修复，3%过氧化氢阻断过氧化物酶，室温下采用山羊血清封闭，分别添加兔抗人HEG1多克隆抗体[货号ab121343，艾博抗(上海)贸易有限公司]、兔抗人KRIT1单克隆抗体(浓度1∶5 000)(货号H00000889- K，亚诺法生技股份有限公司)孵育过夜，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)清洗后添加二抗孵育2 h，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色，封片，镜下观察结果。

1.2.3 结果判断 采用阳性细胞百分比与染色强度乘积对结果进行评价[6]。阳性细胞百分比：<5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分别为0、1、2、3、4分；染色强度：无色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别为0、1、2、3分。两项乘积≤2分定义为阴性，>2分为阳性。

1.2.4 数据库分析 通过Ualcan数据库(http:∥ualcan.path.uab.edu/)分析HEG1、KRIT1 mRNA在胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织中的表达水平，并以HEG1、KRIT1 mRNA中位数为高、低表达界值，分析HEG1、KRIT1 mRNA水平与胃癌预后的关系。

1.3 随访

术后对患者进行5年随访，所有患者均给予规范化治疗(包括化疗、靶向治疗、免疫治疗等)，至患者死亡或于2021年9月结束随访。随访通过门诊复查、微信、电话等方式进行，术后第1年每3～6个月随访1次，术后第2～第5年每6～12个月随访1次，随访记录完整，随访率为100%。统计患者的生存情况。

1.4 统计学处理

采用SPSS 23.0软件分析数据。计数资料以例数和百分比描述，行χ2检验；Spearman法分析胃癌组织中HEG1、KRIT1蛋白表达的相关性；Kaplan- Meier法评估HEG1、KRIT1蛋白表达与胃癌患者总生存率的关系；Cox回归分析影响胃癌患者预后的因素。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 Ualcan数据库胃癌组织HEG1、KRIT1 mRNA表达水平比较

Ualcan数据库显示，胃癌组织中HEG1、KRIT1 mRNA表达水平均高于正常组织(P<0.05)。见图1、2。

图1 Ualcan数据库分析胃癌组织中HEG1 mRNA表达水平

图2 Ualcan数据库分析胃癌组织中KRIT1 mRNA表达水平

2.2 不同组织中HEG1、KRIT1蛋白表达的差异

胃癌组织HEG1、KRIT1蛋白阳性率均高于癌旁正常黏膜组织(P<0.05)。见表1和图3、4。

图3 胃癌组织及癌旁正常黏膜组织中HEG1蛋白表达(×400) A.胃癌组织HEG1蛋白阴性表达； B.胃癌组织HEG1蛋白阳性表达； C.癌旁正常黏膜组织HEG1蛋白阴性表达； D.癌旁正常黏膜组织HEG1蛋白阳性表达

表1 不同组织中HEG1、KRIT1蛋白表达差异 例

2.3 胃癌组织中HEG1、KRIT1蛋白阳性率与患者临床病理特征的关系

不同性别、年龄及肿瘤直径患者胃癌组织中HEG1、KRIT1蛋白阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；胃癌组织中HEG1、KRIT1蛋白阳性率与患者胃癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移有关(P<0.05)。见表2。

表2 胃癌组织中HEG1、KRIT1蛋白阳性率与患者临床病理特征的关系 例

2.4 胃癌组织中HEG1与KRIT1蛋白表达的相关性分析

Spearman法分析显示，胃癌组织中HEG1与KRIT1蛋白表达呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3 胃癌组织中HEG1与KRIT1蛋白表达的相关性分析 例

2.5 Ualcan数据库中HEG1、KRIT1mRNA表达水平与胃癌患者预后的关系

Ualcan数据库显示，HEG1 mRNA高表达患者总生存率低于HEG1 mRNA低表达患者(P<0.05)；KRIT1 mRNA高表达患者总生存率低于KRIT1 mRNA低表达患者，但两者差异无统计学意义(P>0.05)。见图5、6。

2.6 胃癌组织中HEG1、KRIT1蛋白表达与患者总生存率的关系

随访5年，胃癌患者总生存率为43.53%(37/85)。采用Kaplan- Meier法分析HEG1、KRIT1蛋白表达与患者总生存率的关系，结果显示，HEG1蛋白阳性表达者总生存率为36.67%(22/60)，明显低于HEG1阴性表达者的60.00%(15/25)，两者比较，log- rank值为4.312，P=0.038，见图7；KRIT1蛋白阳性表达者总生存率为26.67%(7/30)，明显低于KRIT1阴性表达者的52.73%(29/55)，两者比较，log- rank值为7.209，P=0.007，见图8。

图4 胃癌组织及癌旁正常黏膜组织中KRIT1蛋白表达(×400) A.胃癌组织KRIT1蛋白阴性表达； B.胃癌组织KRIT1蛋白阳性表达； C.癌旁正常黏膜组织KRIT1蛋白阴性表达； D.癌旁正常黏膜组织KRIT1蛋白阳性表达

图5 Ualcan数据库中HEG1 mRNA表达与胃癌患者预后的关系

图6 Ualcan数据库中KRIT1 mRNA表达与胃癌患者预后的关系

图7 胃癌组织中HEG1蛋白表达与患者生存的关系

图8 胃癌组织中KRIT1蛋白表达与患者生存的关系

将HEG1、KRIT1蛋白同时表达阳性的27例患者作为A组，其余58例患者作为B组。Kaplan- Meier法分析显示，A组总生存率为14.81%(4/27)，明显低于B组的56.90%(33/58)，两组比较，log- rank值为35.436，P=0.000，见图9。

图9 胃癌组织中不同HEG1、KRIT1蛋白表达与患者生存的关系

2.7 影响胃癌患者预后的因素分析

Cox回归分析结果显示，肿瘤低分化、有淋巴结转移、HEG1蛋白阳性及KRIT1蛋白阳性是影响胃癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)，见表4。

表4 影响胃癌患者预后的因素分析

3 讨 论

胃癌是全球所有恶性肿瘤中第五大最常见和第三大癌症相关死亡原因，2013—2015年中国胃癌患者5年总生存率低于35%[7]。早期胃癌病变仅限于胃黏膜及黏膜下层，但因缺乏特异性症状，80%以上的患者被确诊时处于晚期，通常需要手术治疗，即使采用先进的全身治疗方法，仍需进行远端胃及淋巴结切除，预后较差[8]。因此，探究胃癌的分子机制，寻找新的治疗靶点及预后预测指标意义重大。

HEG1是一种高度特异和敏感的间皮瘤标志物，可用于鉴别上皮样、双相型恶性间皮瘤[9]。Zhao等[10]研究发现，HEG1在人肝癌组织和细胞株中均呈高表达，可在体外及体内环境中促进肝癌细胞的转移、侵袭，诱导上皮间质转化，且HEG1高表达能够预测肝癌患者的不良预后，可作为肝癌的预后标志物及治疗靶标。然而HEG1在胃癌中作用的相关研究较少，通过检索Ualcan数据库发现，胃癌组织中HEG1 mRNA水平高于正常胃黏膜组织，且HEG1 mRNA高表达患者总生存率低于低表达患者，提示HEG1可能参与胃癌的发生发展。本研究结果发现，胃癌组织中HEG1蛋白阳性率高于癌旁正常黏膜组织，与Ualcan数据库结果一致。此外，HEG1蛋白阳性率与患者胃癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移有关，HEG1蛋白阳性表达者总生存率明显低于HEG1阴性表达者，推测HEG1能够促进胃癌细胞转移、侵袭等过程，从而参与胃癌疾病进展，影响患者预后。

KRIT1能够调节钙黏蛋白介导的细胞- 细胞连接、整合素介导的细胞- 基质黏附、血管内皮生长因子信号，以及由Krüppel样因子家族的血流敏感转录因子介导的机械转导通路等[11]。KRIT1还与主要的氧化还原敏感信号通路有关，参与调节促氧化和抗氧化通路以及自噬等[12- 13]。而本研究结果与Ualcan数据库结果一致，胃癌组织中KRIT1蛋白阳性率明显高于癌旁正常黏膜组织，KRIT1蛋白阳性率与胃癌患者临床病理特征有关，提示KRIT1可能通过影响肿瘤生长过程中的血管生成及血管通透性，参与胃癌的发生发展。Ualcan数据库结果显示，KRIT1 mRNA高表达患者总生存率较低表达患者低，但两者差异无统计学意义，本研究结果则显示KRIT1蛋白阳性表达者总生存率明显低于KRIT1阴性表达者，可能是由于样本量的差异及随访时间的不同所导致。此外，本研究还发现肿瘤低分化、有淋巴结转移、HEG1蛋白阳性及KRIT1蛋白阳性是影响胃癌患者预后的独立危险因素，且HEG1、KRIT1蛋白同时表达阳性的患者具有更低的生存率，进一步提示HEG1、KRIT1蛋白表达与胃癌患者预后有关，可能作为评估预后的重要指标。研究报道，KRIT1 FERM结构域可与HEG1细胞质尾部C端结合形成蛋白复合体，用于稳定内皮连接，HEG1- KRIT1相互作用的完整性与内皮细胞对血流反应的核心转录因子密切相关[14]。本研究通过Spearman法分析显示，胃癌组织中HEG1、KRIT1蛋白表达呈正相关，提示二者可能通过相互作用，影响胃癌生长过程中的血管生成。

综上所述，胃癌组织中HEG1、KRIT1均呈高表达，二者水平可预测患者预后，有望成为胃癌预后的标志物。但HEG1、KRIT1在胃癌发生发展过程中的具体作用机制仍需通过细胞或动物实验进一步探究。