番石榴叶精油的提取、成分鉴定及对红火蚁的生物活性分析

邵雪花，赖 多，肖维强，刘传和，贺 涵，匡石滋

（广东省农业科学院果树研究所/农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室/广东省热带亚热带果树研究重点实验室，广州 510640）

0 引言

红火蚁(Solenopsis invicta Buren)原发生于南美洲巴拉那河流域，是一种具有强大的繁殖力和竞争力的外来入侵害虫[1]，其破坏能力强、繁殖快、食性杂、竞争力强且传播途径多，被列入自然界中100种最具危害性的外来入侵物种之一。该害虫不仅对农林业和环境安全产生巨大危害，还具有较强的攻击性，严重危害人类健康[2]。2004年9月首次在中国广东省吴川市发现[3]，到2021年农业农村部公布的数据显示，红火蚁已入侵至12个省份，448个县（市、区）[4]，可见其扩散快，防控难。目前对红火蚁的防治主要是以化学防治为主，但长期大量使用化学农药不仅会对非靶标生物造成伤害，而且会对农、城乡土壤、水源造成了不同程度的污染。研究发现一些触杀性的化学药剂如氟蚁腙和氟虫腈等，长期使用会导致蚁巢内的红火蚁逃逸、分巢，可加快红火蚁的扩散蔓延[5-6]。虽然中国已投入大批量生产的红火蚁药剂有20多个品种，但高效稳定环保的防治药剂仍较缺乏，药剂产品质量不稳定，防治效果参差不齐。植物源农药是一类来源广、易获得的天然产物，且具有生物降解快、害虫不易产生抗性、对环境和非靶标生物低毒等特点，已成为开发红火蚁高效、低毒药剂研究的重点。

番石榴(Psidium guajava L.)又称芭乐、拔子、喇叭果、鸡屎果等，为桃金娘科(Myrtaces)番石榴属热带果树，原产于热带美洲[7]，在中国福建、台湾、广东、海南等地均有种植，是广东省重点发展的亚热带名优水果品种之一[8]。番石榴中化学成分种类丰富，研究表明，果中含有较丰富的蛋白质、维生素等营养物质[9]，以及果胶、生物碱、类黄酮、三萜类、皂苷等生物活性物质[10-11]；叶中则含有三萜、黄酮、鞣质、倍半萜、挥发油等多种结构类型的化学成分[12-13]。其果、叶具有一定的食用价值，同时也具有出色的药用价值，药理研究表明，番石榴具有抗氧化、抗菌、抗腹泻、保肝、降血糖、降血脂、降血压、抗心血管疾病、抗肿瘤等功效[14-16]。早在1998年，SANTOS等[17]报道了番石榴叶精油及其主要成分β-石竹烯和蒎烯的镇痛作用；SANCHES等[18]分别使用水和乙醇从番石榴叶、根和茎皮中提取化合物，发现提取物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有抗菌作用；RIZZO等[19]报道，番石榴叶中杂萜类成分guajadial、psidial A、psiguadial A和psiguadial B可明显抑制乳腺癌细胞的增殖，且比临床化疗药物对机体的毒性更低。但到目前为止，尚无番石榴精油对红火蚁生物活性的相关报道。鉴于此，本文以番石榴叶为试材，提取其精油，确定其化学成分，并采用熏蒸法探究该精油中的挥发性物质对红火蚁的生物活性，以期为红火蚁生物防治药剂的开发利用提供借鉴与参考。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

红火蚁：采自广东省农业科学院果树研究所的柑橘园内。

番石榴叶片：采自广东省农业科学院果树研究所内。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理 红火蚁：室内搁置3～5天后，用“滴水法”将蚁群从土壤中逼出，转移至较小的储物盒。用纱网将红火蚁转移至内侧壁上涂有滑石粉的塑料盒中饲养。塑料盒中放有人工蚁巢、水试管、10%蔗糖溶液和黄粉虫。于养虫室人工饲养2周后进行试验。养虫室温度为(25±2)℃，湿度为(55±10)%，采用大小一致平均头宽为0.7(±0.1)mm的小型工蚁进行试验。

番石榴精油(EO)提取：将鲜叶40℃烘干至恒重，粉碎后过20目筛[20]。称取500 g番石榴干燥叶粉置于5 L的圆底烧瓶，按1:11(g/m L)的料液比加蒸馏水浸泡2 h，用700W功率微波照射4m in，连接回流冷凝管，油浴加热提取5 h，待挥发油不再增加时停止加热。将收集的挥发油按体积比1:1加正己烷进行萃取，静止4 h后分离，旋蒸后的液体加无水硫酸钠脱水后即番石榴叶精油。

精油成分分析：称取番石榴叶精油2mg于1.5m L进样瓶中，加入正己烷1m L振荡使其溶解，0.22μm微孔滤膜过滤后，通过GC-MS进行分析。精油的GCMS定量分析采用峰面积归一化法，化合物定性采用NIST标准谱库[21]。

1.2.2 熏蒸活性测定 试验容器为带盖的玻璃圆筒（5 cm直径×10 cm高），在杯口至以下2 cm处涂上滑石粉，以防红火蚁逃脱。挑取适宜的工蚁30头放入容器中，加入水试管（在2m L离心管中装水并用棉花封口）提供水分。将5、10、20μL番石榴精油分别装入有8个针孔的1.5m L离心管中，然后将管置于圆筒底部。对照(CK)只放入盛水试管，用保鲜膜密封，3次重复，分别在处理12、24、36、48 h后进行观察记录。

1.2.3 红火蚁行为能力测定 红火蚁处理方法同1.2.2。参照文献[22]的方法，在熏蒸1、3、5、7、9 h后，观察测定红火蚁的聚集率、攀爬率、抓附率和行走率，3次重复。3只及3只以上成团确定为聚集；将红火蚁引上标记好距离的竹签上，在竹签上爬行6 cm则确定为具有攀爬能力；用竹签将红火蚁挑入塑料杯中，轻微震动塑料杯使红火蚁工蚁在杯底处散开，翻转该塑料杯使杯口向下，5 s后未掉落的工蚁则被认为具有抓附能力；红火蚁放在画圆的白纸上，让红火蚁自然行走，能连续行走3 s的则确定为具有行走能力。每个时间段测试结束后将红火蚁接回原杯。

1.2.4 酶活力测定 取约0.1 g红火蚁（处理：番石榴精油10μL/管；对照：清水），加入1m L提取液，进行冰浴匀浆。4℃12000 r/m in离心10m in，取上清，置冰上待测。参考试剂盒（苏州格锐思生物科技有限公司，G0105W；G0908W）说明书的方法进行并略作改进。酶标仪预热30 m in以上，调节波长至510 nm测定CAT，450 nm处测定CarE。

W为样本质量，g；D为稀释倍数，若未稀释则值为1。

1.2.5 生物碱测定 取活的红火蚁（处理：番石榴精油10μL/管；对照：清水）后腹部称取1 g于-20℃的冰箱中1 h，取出后用3.5m L色谱级正己烷浸提48 h，取出浸提液，加入少量无水硫酸钠处理12 h后，用高纯氮气吹至1m L，置于4℃冰箱冷藏备用。取1.0m L工蚁浸提液，用硅胶柱层析法（20.0 g 300～400目硅胶载入直径17mm玻璃柱）分离生物碱。用正己烷与丙酮按比例冲洗硅胶柱并收集流分，用GC-MS（美国Agelent Technologies公司7890A-5975C）分析其所含的生物碱成分及其相对含量。

1.3 数据分析

试验采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析，P<0.05表示差异显著；采用GraphPad Prism 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 番石榴叶精油(EO)的成分鉴定

利用GC-MS进行EO的化学成分分析，发现主要是单萜、倍半烯萜、醇、醛、酮和酯的混合物。由表1可知，共鉴定出31种化合物，占EO总量的89.35%。其中，倍半烯萜类化合物含量最高，占EO总量的76.41%，其主要化合物为caryophyllene(37.86%)，其次是(z)-α-bisabolene(8.69%)、(4E,8E)-β-humulene(7.43%)和α-santalene(6.66%)；醇类占EO总量的11.43%，其中nerolidol是主要化合物含量为7.61%，其次是[1R-(1α,3)]-4-ethenyl- α,α,4-trimethyl-3-(1-methylethenyl)-cyclohexanemethanol含量为2.19%。

表1 番石榴精油的化学成分

续表1

2.2 番石榴叶精油(EO)对红火蚁的熏蒸活性测定

从图1可以看出，EO可致小型红火蚁工蚁死亡，且随剂量升高和时间延长呈上升趋势。EO为5µL/管，熏蒸时间在12、24、36 h时对红火蚁没有明显的活性，与对照组相比差异均不显著(P＞0.05)，48 h的死亡率为9.8%，与对照组相比差异显著(P＜0.05)。10µL/管和20µL/管的EO对红火蚁的熏蒸活性，与对照组相比差异均显著(P＜0.05)，且在48 h红火蚁的死亡率分别为61.55%和93.71%。可见，低剂量的EO对红火蚁的活性较差，当剂量高于10µL/管时，EO对小型红火蚁具有较好的熏蒸活性。

图1 番石榴叶精油(EO)对红火蚁的熏蒸活性

2.3 番石榴叶精油(EO)对红火蚁行为能力的影响

2.3.1 聚集率 从图2看出，小型红火蚁的聚集率随处理剂量升高和时间延长而降低，且不同处理剂量和时间分别与对照组相比，聚集率均呈显著下降趋势(P＜0.05)。5µL/管的EO熏蒸红火蚁1 h到9 h，聚集率从87.27%下降至58.31%；10µL/管的聚集率从87.78%下降至37.51%；20µL/管的聚集率从88.42%下降至10.82%；而对照组的红火蚁聚集率仅下降了10%左右。可见，EO的剂量越高红火蚁聚集率下降越快。

2.3.2 攀爬率 由图2可知，EO在中低剂量（10µL/管和5µL/管）下对红火蚁的攀爬率有抑制效果，但效果较差，5 h前与对照组相比差异不显著(P＞0.05)；EO 20µL/管熏蒸红火蚁9 h后，其攀爬率下降了45%左右，而EO 5µL/管和10µL/管的处理组只下降了10%左右，对照组仅下降1%。可见，EO在较高剂量下对红火蚁的攀爬行为有显著的抑制作用。

2.3.3 抓附率 EO对红火蚁的抓附率有明显的抑制效果，且剂量越高抑制效果越显著（图2）。处理后1 h到9 h，20µL/管的EO熏蒸后红火蚁的抓附率下降了34%左右，10 µL/管的下降了24%左右，而5µL/管的下降了20%左右，对照组仅下降9%左右。可见，EO在较高剂量（10µL/管和20µL/管）下对红火蚁的攀爬行为有显著抑制活性，与对照相比显著下降(P＜0.05)。

图2 番石榴精油(EO)对红火蚁聚集率、攀爬率、抓附率和行走率的影响

2.3.4 行走率 EO熏蒸红火蚁3 h后，高剂量（20µL/管）处理的红火蚁行走率呈显著下降趋势(P＜0.05)，熏蒸1 h到9 h，行走率从97.77%下降至57.23%；EO 5µL/管和10µL/管处理下仅下降了10%左右，且2个剂量处理下的抑制效果并无显著差异(P＞0.05)；对照组的红火蚁行走率保持在99%左右。可见，EO可显著抑制红火蚁的行走行为。

2.4 EO对红火蚁体内CarE和CAT的影响

由表2可知，EO 10 µL/管熏蒸红火蚁12、24、36、48、60 h后，处理组的过氧化氢酶(CAT)的活性呈下降趋势，并显著低于对照组(P＜0.05)，处理60 h后，由8.41 μmoL/(min·g)下降至3.93 μmoL/(m in·g)。EO熏蒸后的红火蚁体内羧酸酯酶(CarE)的活性也呈下降趋势，但处理12 h和24 h后与对照组相比差异不显著(P＞0.05)；36、48、72 h后均呈显著下降趋势(P<0.05)。这说明小型红火蚁工蚁经EO熏蒸处理后，其体内CAT和CarE的活性均显著下降。

表2 番石榴叶精油熏蒸红火蚁后体内酯酶的活性

2.5 番石榴精油对红火蚁体内生物碱的影响

红火蚁具有很强的攻击性，对人最直接的危害就是它们的蜇咬行为会造成局部强烈的灼烧感，被大量红火蚁蜇咬的人可能昏迷甚至死亡。红火蚁的强大毒力与其毒腺分泌物密切相关，这类化合物的主要成分是哌啶生物碱混合物。通过对番石榴精油处理前后红火蚁生物碱组分分析，发现处理后的红火蚁只检测到6种生物碱，而对照组检测到12种。即化合物1-piperidine，1-piperidine，4-chloro-1-methyl-piperidine，2-methyl-6-tridecyl-6-piperideine，3,5-dichlorobenzoate-2-piperidine和1-(2-phenylethyl)-piperidine 6种生物碱在番石榴精油处理后未被检测到（表3）。由此可见，番石榴精油可阻碍红火蚁的毒腺分泌，降低其毒性。

表3 红火蚁体内生物碱含量检测

3 讨论与结论

本研究发现，番石榴叶精油(EO)的主要成分为caryophyllene、(z)-α-bisabolene、(4E,8E)-β-humulene、α-santalene和nerolidol，这与以往研究中发现的主要成分 为 isocaryophyllene、veridiflorene、farnesene、dllimonene、d-cadinene、α-copaene 和 a-humuleneandιcadinol不同[23]。已有研究表明，同一植物精油的化学成分不同，这与特定的气候条件、土壤条件、所收集植物的品种、部位及收集时间和提取方法等因素相关[24-25]。FERNANDES等[26]从番石榴花中提取精油，发现主要成分是 α-selinene、β-selinene、α-cadinol、βcaryophyllene、 caryophyllene oxide 和 nerolidol；Azulene、caryophyllene、cineole、eucalyptol和 copaene Azulene是印度番石榴叶精油的主要成分[27]。可见，番石榴不同品种、不同部位及不同采集地点会导致其提取的精油成分差异较大。

以往研究结果表明，番石榴叶精油具有抗氧化、抗菌和抗癌等多种生物活性，但在防控红火蚁方面未见报道。红火蚁作为最具危害性的外来入侵物种之一，其繁殖快、扩散能力强，防控难，高毒性化学农药通常会导致蚁巢内的红火蚁逃逸、分巢，加快红火蚁的扩散蔓延。红火蚁工蚁一般在蚁群中负责食物搬运、传递信息、寻找蚁穴等职能，其聚集、攀爬、行走和抓附能力对其生存、觅食及迁巢等具有重作用，抑制其行为能力，可有效控制其种群扩散、蔓延。本文中笔者发掘番石榴叶精油对小型红火蚁工蚁具备良好的熏蒸活性，可显著降低红火蚁的聚集、攀爬、抓附和行走等行为能力，且在试验剂量范围内，随剂量的增加和时间的延长防控效果增强；另一方面番石榴叶精油还可阻碍红火蚁毒腺生物碱的分泌，使哌啶化合物的组分降低50%。红火蚁具有蛰针，能够分泌毒液，具有强烈的进攻性，在生物种群竞争中有一定优势[28]，毒腺生物碱是红火蚁攻击危害的主要毒素成分，与红火蚁能够成功入侵并定殖有重要关系。番石榴精油在高浓度下对小型红火蚁工蚁有较好的熏蒸活性，低浓度下可抑制其行为能力及生物碱的分泌，可有效控制红火蚁的种群数量及迁巢和扩散，同时减轻对人类造成的危害，这在红火蚁的综合防治上有广阔的开发应用前景，但需要大量田间实验进行验证，并与化学农药有机结合，可有望达到最佳防治效果。

当机体的氧化与抗氧化系统之间的平衡状态被打破时，会产生丙二醛(MDA)，MDA具有细胞毒性。过氧化氢酶(CAT)是一类主要起催化底物氧化还原反应的酶，能增强机体对羟基自由基及超氧阴离子的抑制能力，并且可显著减少MDA的含量[29]。羧酸酯酶(CarE)是昆虫体内重要的一种解毒酶，几乎在昆虫的各个组织中均有分布，CarE可通过阻断作用来分解外源有毒有害物质进行解毒，或与有毒物质相结合使其无法达到作用靶标。本研究显示，番石榴精油熏蒸红火蚁不同时间后，供试红火蚁体内的过氧化氢酶(CAT)和羧酸酯酶(CarE)活性均显著低于对照。可见，该精油可破坏机体的氧化与抗氧化系统之间的平衡，导致红火蚁的解毒能力降低，延长番石榴精油在红火蚁体内的作用时间加速其死亡，但其作用机理仍需深入探讨。

综上所述，番石榴叶精油可通过蒸馏法进行有效提取，其成分经GC-MS鉴定可得到31种化合物，占总含量的89.35%，其中caryophyllene(37.86%)为主要化合物 ，其 次 是 (z)-α-bisabolene(8.69%)、(4E,8E)-βhumulene(7.43%)和 α-santalene(6.66%)；生测结果表明，20µL/管的精油熏蒸红火蚁工蚁48 h，死亡率达90%以上；20µL/管精油熏蒸红火蚁9 h，其聚集率从88.42%下降至10.82%，攀爬率下降了45%左右，抓附率下降了34%，行走率从97.77%下降至57.23%；体内保护酶过氧化氢酶(CAT)和羧酸酯酶(CarE)酶活力分别降低了56.62%和58.57%；哌啶化合物的组分降低了50%。可见，番石榴叶精油不仅对红火蚁表现出优异的熏蒸活性，还可显著抑制红火蚁的行为能力（聚集、攀爬、抓附和行走），同时降低体内CAT和CarE的酶活力并抑制生物碱的分泌，本研究为后期番石榴的深度开发提供理论依据，还为红火蚁的生物防治提供借鉴。