阶梯式耳聋基因诊断策略及其临床实践

刘畅 黄演林 汪安石 张彦 丁红珂 曾玉坤 刘渊 刘玲 吴菁 尹爱华

耳聋是人类常见的疾病之一，与遗传因素密切相关［1⁃2］。据报道，约50%的语前聋与遗传因素有关，且遗传因素在许多迟发性进行性听力下降、年龄相关性耳聋的发生中也发挥着不可忽视的作用［1⁃4］。明确致病基因变异、阐明分子致病机制，可为临床诊断、治疗和预防提供重要依据［3⁃5］。迄今为止，超过200 个综合征性（syndromic hearing loos，SHL）和非综合征性耳聋（non⁃syndromic hearing loss，NSHL）基因被发现（http：//deafnessvariationda⁃tabase.org）［3⁃4］。在中国耳聋人群中，较常见的致聋基因包括GJB2、SLC26A4和线粒体DNA 12S rRNA基因，约占耳聋病例的30%～40%［5］。高度的遗传异质性给耳聋的分子诊断带来巨大的挑战。耳聋基因的变异类型多样，包括点变异、小片段插入缺失（Indel）、拷贝数变异（Copy number variation，CNV）、结构变异（Structural variation，SV）等，单一检测技术难以奏效［6］。目前，用于遗传性耳聋诊断的方法主要包括基因芯片、基因Sanger 测序以及基于下一代测序（next⁃generation sequencing，NGS）技术的目标耳聋基因靶向捕获测序、全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）及全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）等［7⁃8］。Sanger 测序在包括GJB2、SLC26A4等较常见的致聋基因检测中发挥着重要作用，同时对于可产生特征性临床表型的少数基因的检测也具有一定意义［3］。在充分考虑检测效能、检测成本、检测时间等因素的前提下，本单位制定了一套阶梯式基因诊断策略，并将其应用于耳聋患者分子诊断的临床实践。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2020年12月广东省妇幼保健院医学遗传中心226 例耳聋患者进行基因诊断。纳入的人群均为感音神经性耳聋或混合性耳聋患者，排除单纯的传导性耳聋患者。对入组耳聋患者进行病史收集及体格检查，包括详细的过往病史、耳聋家族史、听力学检查情况、发病年龄及诱因、感染史、氨基糖苷类药物接触史等。226例耳聋患者中男134 例、女92 例（男女比例1.5∶1），其中语前聋（发病年龄≤3 岁）203 例（89.8%）、语后聋23 例（10.2%），有耳聋家族史12 例（5.3%）、无耳聋家族史209 例（92.5%）、耳聋家族史不详5 例（2.2%），有氨基糖苷类药物接触史11例（4.9%）、无氨基糖苷类药物接触史209 例（92.5%）、氨基糖苷类药物接触史不详6例（2.7%）。患者听力损失程度如下：轻度2 例（0.9%）、中度16 例（7.1%）、重度129 例（57.1%）、极重度例40例（17.7%）、听力损失程度不详39 例（17.2%）。本研究经院伦理委员会审核通过。受检者（监护人）充分知情同意，并签署知情同意书。

1.2 阶梯式基因诊断策略

本研究根据广东省聋病诊疗的基本情况，综合考虑各项实验技术的检测效力、检测时间与检测成本，设计了一套适合广东地区实际情况的聋病阶梯式基因诊断策略。见图1。阶梯式诊断策略第一阶梯基因诊断采用微阵列芯片法对受检者进 行GJB2、GJB3、SLC26A4及线粒体DNA 12S rRNA基因上的中国人群耳聋基因变异热点检测。第二阶梯基因诊断用于第一阶梯基因诊断未检出或仅检出单个常染色体隐形遗传致病变异的病患，采用Sanger 测序法对受检者进行GJB2基因、SLC26A4基因等中国人群中较常见的耳聋基因测序。对于可产生特征性临床表型的少数基因，因其临床表型对耳聋基因的检测具有指向性，也常应用候选基因筛选的策略在第二阶梯基因诊断中进行分子遗传学诊断。第三阶梯基因诊断主要用于第一、二阶梯基因诊断未检出或检出结果不能解释表型的耳聋病患，但对于由表型判断为非GJB2、GJB3、SLC26A4及线粒体DNA 12S rRNA基因变异致聋患者、部分综合征性耳聋患者、有急切产前诊断需求等检测时间窗较短的耳聋患者可直接接受高通量测序检测。

图1 阶梯式耳聋基因诊断策略Figure 1 A stepwise approach for the genetic diagnosis of hearing loss

1.3 第一检测阶梯——微阵列芯片法

采集受检者外周血2 mL，提取基因组DNA。使用微阵列芯片法晶芯®九项遗传性耳聋基因检测试剂盒（北京博奥生物有限公司，国食药监械（准）字2009 第3400725）对受检者进行GJB2基因c.35 del G、c.176_191 del 16bp、c.235 del C、c.299_300 del AT，GJB3基因c.538 C>T，SLC26A4基因c.2168 A>G、c.919_2 A>G，线粒体DNA 12S rRNA基因m.1494 C>T、m.1555 A>G 中国人群耳聋基因变异热点筛查。根据试剂盒说明书，通过多重不对称等位基因特异性PCR 扩增获得大量单链DNA，PCR 产物变性后与芯片杂交，芯片洗涤后经晶芯LuxScan 10K⁃B 微阵列芯片扫描仪（北京博奥生物有限公司）扫描成像并使用配套软件进行结果判读［9］。

1.4 第二检测阶梯——Sanger 测序法

对GJB2、SLC26A4等基因编码区及侧翼序列使用巢式聚合酶链式反应扩增，引物序列及PCR反应条件参见文献［10⁃11］，扩增产物送广州天一辉远基因科技有限公司进行测序。DNA 测序结果用Mutation Surveyor 软件（SoftGenetics，State Col⁃lege，PA）与NCBI 网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的参考序列进行序列比对与分析。

1.5 第三检测阶梯——全外显子组测序法

质检合格的基因组DNA 经超声破碎仪打断、末端修复、扩增、纯化等操作制备测序文库，采用特异性的捕获探针（Roche NimbleGen，Madison，WI）杂交富集目标区域的DNA 序列，目标区域包括OMIM 相关的约5 000 个靶基因的全部外显子区及上下游各30 bp 内含子区和已知的深度内含子区变异，随后在Illumina NovaSeq 6000 平台上进行二代测序。使用NextGENe 软件将测序Reads与人的参考基因组（GRCh37/hg19）进行序列比对。单个核苷酸变异（SNV/indels）分析方法为：通过变异的人群频率数据库（ExAC、gnomAD、1000 genomes 等）对高频变异进行过滤，参考dbSNP、OMIM、ClinVar、Varsome、HGMD、LOVD、Deaf⁃ness Variation Database 等多种数据库对致病变异位点进行评估，应用Varsome 网站及pliceAI 软件（BayesDel_addAF、DANN、DEOGEN2、EIGEN、FATHMM⁃MKL、M⁃CAP、MVP、MutationAssessor、MutationTaster、REVEL、SIFT 及GERP）等对变异的保守性和致病性进行预测［11⁃12］。根据美国医学遗传学学会（American College of Medical Genet⁃ics，ACMG）指南对点变异和拷贝数变异的致病性进行分类（PMID：25741868）。

2 结果

2.1 第一检测阶梯——微阵列芯片法

165 例耳聋患者接受了第一阶梯基因诊断，28例检出芯片所包含的变异热点。其中，12 例为GJB2基因、SLC26A4基因致病变异的纯合或复合杂合形式，基因型可解释临床表型。1 例携带线粒体DNA 12S rRNA基因m.1494 C>T 同质性变异、1 例携带线粒体DNA 12S rRNA基因m.1555 A>G同质性变异，与其接触氨基糖苷类药物后出现听力损失的病史符合。另有14 例携带GJB2基因、SLC26A4基因上芯片所包含的单等位基因致病变异，进入第二检测阶梯。

2.2 第二检测阶梯——Sanger 测序法

检出24 例GJB2基因、SLC26A4基因致病变异的纯合或复合杂合形式，其中14 例为GJB2基因致病变异的纯合或复合杂合子、10 例为SLC26A4基因致病变异的纯合或复合杂合子，基因型可解释临床表型。另有21 例携带GJB2基因、SLC26A4基因致病变异的杂合形式，建议进入第三检测阶梯。

2.3 第三检测阶梯——全外显子组测序法

共95 个耳聋病患接受了外显子组测序检测，38 例明确了分子诊断，诊断率为40%。38 例明确分子诊断的病例中14 例系由GJB2基因、SLC26A4基因变异致聋。余24 例明确分子诊断病例的致病变异分布于15 个基因，其中7 个遵循常染色体隐性遗传模式、8 个遵循常染色体显性遗传模式，见图2。

图2 确诊病例的耳聋基因变异谱Figure 2 Genetic spectrum of diagnosed patients with hearing loss

3 讨论

本研究根据广东省聋病诊疗的基本情况，综合考虑各项实验技术的检测效力、检测时间与检测成本，设计了一套适合广东地区实际情况的聋病的阶梯式基因诊断策略。阶梯式诊断策略第一阶梯基因诊断采用微阵列芯片法对受检者进行GJB2、GJB3、SLC26A4及线粒体DNA 12S rRNA基因上的9 个中国人群耳聋基因变异热点检测，检测成本为335 元、报告时间为一周。本研究通过第一阶梯基因检测为14 例病患明确分子诊断（诊断率8.5%），并为另外14例病患提示了变异基因。第二阶梯基因诊断采用Sanger 测序法对受检者进行GJB2、SLC26A4等中国人群中较常见的耳聋基因编码区及侧翼序列测定，检测成本为450 元、报告时间为一至三周。本研究结果提示另外21 例携带GJB2、SLC26A4基因编码区杂合性致病变异。第一、二阶梯基因诊断未检出或检出结果不能解释表型的34 耳聋病患，进入第三检测阶梯，外显子组测序为其中11 例明确了分子诊断，诊断率32.4%。由于外显子组测序的成本高达3 360元、报告时间为四周，93例经第一、二阶梯基因检测未能明确诊断的耳聋病患选择退出研究。另有61例由表型判断为非GJB2、GJB3、SLC26A4或线粒体DNA 12S rRNA基因变异致聋患者、部分综合征性耳聋患者、有急切产前诊断需求等检测时间窗较短的耳聋患者选择直接接受全外显子组测序检测，其中27例明确了分子诊断，诊断率44.3%。这27例直接接受全外显子组测序检测而明确诊断的病例中14例系由GJB2基因、SLC26A4基因变异致聋（占比51.9%），这部分病例本可通过第一、二阶梯基因检测进行诊断，但由于有急切产前诊断需求检测时间窗较短等个人原因而选择直接接受外显子组测序检测。所有微阵列芯片法及外显子组测序法检出的致病变异、疑似致病变异及意义不明的基因变异均通过Sanger测序法进行验证，符合率100%。对于有条件的患者家庭，进行家系验证。

本研究中第一、二阶梯基因诊断的检测成本为785 元、报告时间为二至四周，诊断率23.0%，第三阶梯基因诊断的检测成本为3 360 元、报告时间为四周，可额外提高32.4%的诊断率。而直接选择外显子组测序则检测成本为3 360 元、报告时间为四周，诊断率44.3%。可见，通过阶梯式基因诊断策略，从中国人群耳聋基因变异热点入手，到GJB2、SLC26A4等常见耳聋基因编码区及侧翼序列测定，再扩大范围到全外显子测序，呈分层递进式检测，更为经济。但对于有急切产前诊断需求等检测时间窗较短的耳聋患者，直接选择外显子组测序检测更为高效。因而，在现行医保政策下，综合考虑各项实验技术的检测效力、检测时间与检测成本，结合广东省聋病诊疗的临床实践情况，本研究认为阶梯基因诊断策略是有意义的，有保留的必要，而根据实际情况有部分患者可直接选择外显子组测序检测。明确耳聋患者分子诊断有助于提高病人管理、改善患者预后、规范遗传咨询及进行再发风险评估，具有十分重要的临床意义［4，12］。