临床宏基因组测序中正常有菌部位临床标本的处理办法

梁志坤 王琳 吴轶兰 王明义

据世界卫生组织统计，全球感染性疾病导致的患者死亡占全部死因的25%以上，每年约1 300 万儿童死于感染性疾病。在中国，感染性疾病占所有疾病的50%以上［1⁃4］。根本原因是病原诊断技术无法满足临床要求，如传统的培养技术，受培养条件和抗生素使用等影响，培养阳性率较低；传统分子诊断技术通常只能使用特异性的引物或探针检测非常有限的数个靶标，一定程度上限制了其临床应用。而病原宏基因组高通量测序技术（Metagenom⁃ic next⁃generation sequencing，mNGS）依靠其无偏倚、随机的特性不仅可以检测一致病原体的基因组，也可以对新发病原体感染鉴定发挥重要作用［5］。

临床样本类型多种多样，按采集部位，可分为无菌部位（血、无菌体液、组织等）样本和正常有菌部位（呼吸道、尿液、开放性伤口等）样本［5⁃6］。虽然《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》中指出无菌部位标本的诊断价值优于正常有菌部位，但是很多研究和报道也证实各部位感染均具有一定的临床价值［7⁃8］。因此，正常有菌部位（如呼吸道、尿液、开放性伤口等）样本病原的检测在感染性疾病诊断中也是必不可少的。为方便医疗工作者及科研人员了解具体的处理办法，本文对有菌部位样本处理方法进行综述。

1 病原宏基因组高通量测序技术原理

mNGS 检测需经过样本前处理、核酸提取、文库制备、上机测序、数据库对比、报告生成及结果解读等一系列过程［7］，见图1。mNGS 检测技术直接从样本中获得病原体的核酸信息，再通过生物信息学的方法对得到的序列进行比对分析［8］，可以同时检测较大范围的病原体，病毒、细菌、真菌、寄生虫等［5］。

图1 mNGS 技术原理［5］Figure 1 mNGS technology principle［5］

目前，传统的病原诊断技术有微生物的培养和分离、特异性病原抗体的检测和微生物核酸（DNA或RNA）检测（PCR）等［9］（图2），且只能检测一种或多种病原体。对于不同的病原体，不同技术的检测方法有着不同的灵敏度，所以mNGS 技术不能完全替代传统病原诊断技术。因此，需要根据诊断需求选择合适的检测方法。

图2 传统微生物检测技术流程［9］Figure 2 Traditional microbial detection technology process［9］

2 不同类型标本处理方法

要实现mNGS 技术对所有潜在病原微生物无偏倚地检测［5，10］，样本前处理和核酸提取方法就需要兼容不同微生物的特征，例如增加玻璃珠研磨样本，对样本进行离心或过滤以对某种病原体进行富集。需要针对样本的类型做一定前处理，如痰液和肺泡灌洗液样本，黏性较高，需要进行液化处理［8］，液化方法见表1。

表1 液化方法汇总Table 1 Summary of liquefaction methods

上述方法各有优缺点。其次，需要根据痰液、肺泡灌洗液样本的粘稠程度，加入一定比例DTT或者NaOH，较难做成标准化的预处理流程。而且，NaOH 的强碱性，一定程度上影响提取试剂的提取效果。

以下总结了不同实验室针对感染性疾病主要代表类型的正常有菌部位样本处理方法及核酸提取方法。

2.1 呼吸道样本

呼吸道分为上、下两部分。鼻、咽、喉合称上呼吸道。气管、支气管和肺部器官，合称下呼吸道。呼吸道样本样本处理方法如下：

2.1.1 上呼吸道样本

鼻咽拭子和口咽拭子，先使用70～200 μL PBS或者样本保存液，将微生物冲洗下来。按照QIAamp Viral RNA 提取试剂盒说明书进行提取，分为裂解、结合、漂洗、洗脱四个步骤，使用快速离心柱或真空操作简化从无细胞体液中纯化病毒RNA的流程。病毒RNA 特异性结合到QIAamp 硅膜上，然后用水或试剂盒提供的缓冲液洗脱高纯度病毒RNA，该试剂盒可在QIAcube 全自动化核酸纯化提取仪上自动纯化。

2.1.2 下呼吸道样本

胸腔积液样本处理方法如下：可使用MagNA⁃Lyzer®仪（Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany）加上SeptiFast Lysis kit（Roche，Mannheim，Germany）对细菌进行机械破壁来获得DNA，然后在MagNA Pure 紧凑型自动化仪器上进行DNA 提取和纯化（Roche，Mannheim，Germany）［11］。

MagNALyzer®仪可以对较厚细胞壁、难裂解的革兰式阳性菌和真菌进行预处理，加上SeptiFast Lysis kit 使其核酸能更好的释放出来。

痰液样本处理方法如下：不同呼吸道标本的病原类型不一样。一般上呼吸道样本中含有的病原主要是病毒，可采用病毒提取试剂盒来提取核酸。下呼吸道样本中含有大量的细菌、真菌，需要研磨破壁处理，提高核酸提取效率，从而提高mNGS 对真菌检测的灵敏度。不同的呼吸道标本的病原丰度也不一样，其人源核酸占比不同，往往会导致mNGS 检测性能的差异。例如，肺泡灌洗液中含有大量的宿主细胞，可能导致人源核酸挤占大量的数据量，导致假阴性结果。所以需要对样本适当去除人源核酸，反向富集病原体，从而提升阳性检出率。见表2～3。

表2 肺泡灌洗液处理方法Table 2 Approach of bronchoalveolar lavage fluid

表3 痰液处理方法Table 3 Approach of sputum

2.2 粪便

粪便是主要的肠道样本。肠道传染病包括细菌引起的细菌性痢疾、伤寒、副伤寒、霍乱、副霍乱以及食物中毒等；阿米巴原虫引起的阿米巴痢疾；相关病毒引起的病毒性肝炎、脊髓灰质炎（小儿麻痹）等。

粪便样本处理方法如下：肠道样本中病原体核酸占比远大于其他样本类型，可以采用自动化提取系统，在一个相对封闭的提取环境，减少对环境和其他样本的污染。粪便样本含有复杂的微生物组，正常菌群的信息背景高，这会降低mNGS 的灵敏度。可以使用专门针对粪便样本的富集方法（如：珠磨处理）减少信息背景，提高mNGS 检测病原的灵敏度。见表4。

表4 粪便处理方法Table 4 Approach of stool

2.3 尿液

尿路感染是最普遍的社区获得性和医院获得性感染，存在于肾脏，输尿管，膀胱和尿道等泌尿系统的各个部位。研究表明尿路感染是由多种病原微生物引起的，其中大多数是大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌，奇异变形杆菌，粪肠球菌和腐生葡萄球菌。尿路感染主要发生在育龄妇女，老年人和免疫力低下和尿路异常的人中［20］。

尿液样本处理方法如下：尿液样本的提取也可以使用相对封闭的自动化提取仪，减少环境的污染，减少假阳性的检出率。cfDNA也广泛存在尿液当中，可以选择cfDNA 提取试剂盒进行cfDNA 的提取。此外，尿液样本在采集的时候容易受环境的污染，应注意人为污染，这样有利于病原的检出。见表5。

表5 尿液处理方法汇总Table 5 Approach of urine

2.4 牙菌斑

口腔是一个充满各种微生物的环境，而牙菌斑就像是由不同细菌组成的“细菌社区”，这些“社区”定居于牙面、牙与牙之间或者在假牙（义齿、修复体）表面。牙菌斑是基质包裹的互相黏附或黏附于牙面、牙间或修复体表面的软而未矿化的细菌性群体，为不能被水冲去或漱掉的一种细菌性生物膜。牙菌斑样本处理方法如下：牙菌斑又分平画面牙菌斑和窝沟牙菌斑，前者早期以球菌和杆菌为主，大多为革兰阳性菌，链球菌为主要菌群，后者以革兰阳性菌和段杆菌为主，偶见酵母菌。根据牙菌斑的病原丰度来看，在提取核酸前可以使用溶菌酶来提高核酸提取效率。见表6。

表6 牙菌斑处理方法Table 6 Approach of dental black plaque

3 小结

近年来世界卫生组织和国家卫生健康委员会多次强调控制抗生素滥用的重要性，对临床病原诊断提出了更高的要求。在mNGS 检测技术的湿实验部分，仍面临的四大技术挑战是：①如何克服样本中宿主核酸和样本病理的特性；②如何真正实现对病原微生物无偏倚地检测；③如何针对不同种类的临床样本，选择合适的前处理程序；④如何克服检测背景的干扰。各专家共识中也都指出样本前处理和核酸提取为mNGS技术流程的质量控制的重要节点［24］。

本文阐述了主要正常有菌部位样本的特性及处理方法，并举例、对比了不同样本的国内外提取试剂盒厂家的优缺点。综上，在研究中需要根据实验目的及研究重点来选择样本前处理方法和核酸提取方法。