2020年昆明市儿童医院非伤寒沙门菌分子分型和β内酰胺类耐药基因特征分析

王海平 许彬 黄海林 李珏 李小娟 欧晓燕 蒋立

据世界卫生组织估计，全球每年约有5.5 亿人患腹泻病，其中约半数为五岁以下儿童，沙门菌是造成腹泻病的四大病因之一［1］。沙门菌是一种肠杆菌科的革兰氏阴性杆菌，迄今已发现超过两千余种血清型。我国《传染病防治法》［2］规定，沙门菌中的伤寒/副伤寒感染属于乙类传染病，伤寒/副伤寒以外的其他沙门菌感染则被归属到丙类传染病中的“其他感染性腹泻”进行报告管理。中国疾病控制信息系统资料显示，2014-2015年全国累计报告其他感染性腹泻病例1 805 161 例，5 岁以下儿童占总报告病例数的53.7%，非伤寒沙门菌感染居细菌性病原普的首位，占细菌性腹泻确诊病例数的65.5%［3］。因此，非伤寒沙门菌感染是严重威胁我国儿童健康的儿科常见消化系统疾病。本研究旨在对2020年昆明市儿童医院感染性腹泻儿童中分离到的非伤寒沙门菌进行分子分型及耐药基因分析，从而了解昆明地区儿童感染非伤寒沙门菌的流行特征及耐药分布，为儿童非伤寒沙门菌感染防治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2020年1 至12月在昆明市儿童医院消化内科就诊512 例病例。纳入标准：年龄≤5 岁，临床表现每日大便3 次以上，伴有大便性状或量的改变的患者，及大便或血标本中分离到沙门菌者。排除标准：年龄>5 岁，未出现明显胃肠道症状者，或大便或血标本中未分离到沙门菌者。病例信息收集经患者监护人知情同意。研究经本院伦理委员会审批通过。

1.2 细菌分离及培养

1.2.1 粪便标本

采集患者有脓血、粘液部分的粪便2～3 g，液状粪便取絮状物1～2 mL，对于排便困难的婴幼儿使用肛拭采样，标本盛于粪便采集盒中及时送检；送检标本接种到10 mL 亚硒酸盐增菌肉汤（Cata⁃log No.HB8606，海博生物，青岛）中，同时接种到MAC、SS 琼脂平板（Catalog No.20172400133，安图生物，郑州）35℃培养；接种平板过夜后，挑取可疑菌落做生化初步鉴定，生化结果符合者使用兰州生物制品研究所有限责任公司的沙门氏菌属诊断血清进行血清凝集试验；增菌标本每日观察，见浑浊生长，接种于MAC、SS 琼脂平板35℃培养，使用以上方法进行细菌分离及检定。

1.2.2 血液标本

采集部位使用70%酒精擦拭，采集患儿血液2～4 mL，使用BD BACTECTM血培养瓶（Catalog No.8090998）在BD BACTECTM FX（碧迪公司）系统中进行培养，血培养报阳后，使用革兰染色方法见革兰阴性杆菌，接种于MAC、SS 琼脂平板，使用以上描述方法进行细菌分离及检定。

1.3 抗生素药物敏感试验

以上分离的沙门菌株使用梅里埃AST⁃GN14药敏卡（Catalog No.22096）在VITEK 2⁃compact全自动微生物鉴定/药敏分析系统（梅里埃公司）中进行分析，了解分离沙门菌的抗生素耐药率情况。

1.4 沙门菌分子分型

使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法将菌株在CHEF⁃DRIII（Bio⁃Rad Laboratories 公司）电泳仪中进行电泳。获得的PFGE 图像录入BioNumerics（Version 8.0）软件包进行处理。实验步骤根据PulseNet⁃沙门菌标准操作程序（https：//www.cdc.gov/pulsenet/）进行。菌株间相似性系数（SD）达到85%作为判断菌株同源的标准。

1.5 耐药基因检测

使用高通量荧光定量PCR（HT⁃qPCR）方法对以上分离的菌株的56 种ß内酰胺类抗生素耐药基因在StepOnePlus™实时荧光定量PCR 仪（美国Thermo 公司）进行定量分析。各检测样本的Ct（Threshold of cycle）值，以Ct 值≤31 为判断基线。耐药基因含量采用相对定量的方法进行计算，ΔCt=Ct 值⁃待测组内参基因Ct 值（16S rRNA基因），相对含量变化F=2⁃ΔCt。结果使用Heml 软件（Heml 1.0）绘制热度图，描述耐药基因在不同菌株中的分布。

2 结果

2.1 患者流行病学特征

病例主要集中在夏秋季，其中7～8月是发病的高峰，见图1A。超过90%的病例为5岁以下儿童，其中1岁以下儿童占到了确诊数的44%，见图1B。患者中男性患者居多，男女性别比例为2.7∶1。见图1C。

图1 沙门菌感染确诊患者基本情况分布图Figure 1 Characteristics of patients with laboratory confirmed Salmonella infection

2.2 病原学特征

在分离到的41 株沙门菌中，鼠伤寒沙门菌有30 株，占分离菌株总数的73%。见表1。

表1 2020年昆明市儿童医院分离沙门菌株的血清型构成Table 1 Serotypes of Salmonella isolates from Kunming children's Hospital in 2020

优势血清型的10 株鼠伤寒沙门菌的PFGE 分子分型结果见图2。该10 株菌株可分为5 个群，其中5、10、6、7、4 号菌株为一群，2、8 号菌株为一群，其余1，3，9 号菌株各为一群。

图2 10 株鼠伤寒沙门菌PFGE 分析图Figure 2 PFGE analysis of 10 isolates of Salmonella typhimurium

2.3 菌株耐药特征

分离的41 株沙门菌中对一代头孢（头孢唑林）、氨基糖苷类抗生素（阿米卡星、庆大霉素）的耐药率达100%。其中30 株鼠伤寒沙门菌对青霉素类抗生素（氨苄西林）的耐药率也达到了100%，对喹诺酮类抗生素（环丙沙星、左氧氟沙星）的耐药率明显高于其他型沙门菌。见表2。

表2 2020年昆明市儿童医院分离沙门菌株的耐药率［n（%）］Table 1 Antibiotics resistance rate of Salmonella isolates from Kunming Children's Hospital in 2020［n（%）］

对以上进行分子分型的10 株鼠伤寒沙门菌使用HT⁃qPCR 方法检测了其耐药基因的分布情况。在检测的56 种ß 内酰胺类耐药基因中，发现了34种耐药基因。其中blaTEM、blaCTX⁃M3/6、bla⁃OXA1、blaZ、blaPER、PBP5、NDM1耐药基因在检测的10 个菌株中均有发现。其中blaCTX⁃M3/6在1、3、4、9 号菌株中呈高分布，blaTEM在3 号菌株中呈高分布，blaOXA1在1 号菌株中呈高分布。见图3。

图3 10 株鼠伤寒沙门菌ß 内酰胺类耐药基因热点分布图Figure 3 Hot spot distribution of beta⁃lactamase genes in 10 isolates of Salmonella typhimurium

3 讨论

本研究发现，2020年昆明市儿童医院收治的沙门菌感染腹泻儿童主要集中在夏秋季，接近半数患者年龄小于1 岁，男性患者明显高于女性；鼠伤寒沙门菌是本地区流行的优势血清型，部分菌株分子分型存在高度集中趋势，提示其存在同源性的可能；分离的菌株有较高的耐药率，鼠伤寒沙门菌的多重耐药率尤其明显，ß 内酰胺类耐药基因，blaTEM、blaCTX⁃M3/6、及blaOXA1在分析的菌株中均有发现。

国内一大型调查收集了2007-2016年上海、新疆、福建、广西、以及重庆5 个省市的非伤寒沙门菌感染资料［4］，结果显示患者主要集中在≤1岁及≥60岁年龄组，男性构成明显高于女性，发病时间与雨季相关，主要集中在5-10月之间。本研究观察的昆明地区非伤寒沙门菌流行特征与该大型研究基本一致。

目前由于沙门菌核酸检测技术参考品的缺乏，沙门菌的鉴定仍主要依靠传统血清学分型［5］。在之前的我国五省市的非伤寒沙门菌调查中，分离菌株血清型占前三位的分别是肠炎沙门菌、猪霍乱沙门菌、以及鼠伤寒沙门菌［4］。河南省5 岁以下腹泻儿童粪便中非伤寒沙门菌检出较高的分别是肠炎沙门菌，4，5，12：i：⁃型沙门菌，和鼠伤寒沙门菌［6］。而在安徽马鞍山分离的非伤寒沙门菌优势血清型为阿贡纳沙门菌、肠炎沙门菌、和鼠伤寒沙门菌［7］。在本调查中发现鼠伤寒沙门菌是昆明地区流行优势血清型，而肠炎沙门菌与猪霍乱沙门菌未有分离发现。这表明不同地区的流行菌株构成存在明显差异。PFGE 分子分型技术被广泛应用于细菌同源性分析［8］。本研究使用该技术对昆明地区分离的菌株进行同源性分析发现，部分菌株间存在较集中的趋势，这提示，尽管以上菌株同源性较高的病人发病时间不同，但可能存在共同暴露源的可能。

本研究分离到的30 株鼠伤寒沙门菌对氨苄西林、头孢唑林、及氨基糖苷类抗生素的耐药率达到100%，多重耐药率达到了93.33%（28/30），对临床首选儿科用药头孢他定和头孢曲松的耐药率分别高达36.67%及46.67%。徐州地区2014⁃18年5年的监测数据显示，鼠伤寒菌也是呈逐年上升趋势，多重耐药率达到了90.28%，对头孢他定和头孢曲松的耐药率分别达25.0%和37.50%［9］。本研究检出耐药水平明显高于徐州地区。本研究进一步对菌株携带的ß 内酰胺类耐药基因进行检测，发现了34 种耐药基因，其中blaTEM、blaCTX⁃M3/6、及bla⁃OXA1耐药基因携带量较为突出。而在福建省的调查中，blaTEM、blaCTX⁃M、blaOXA耐药基因携带率在腹泻患者菌株中分别为55.74%、16.39%、和19.67%，在健康人员来源株中分别为22.73%、0%、和18.18%［10⁃11］。昆明地区菌株耐药基因携带率明显高于福建地区。以上结果提示，昆明地区非伤寒沙门菌的耐药情况较为严峻，对儿童沙门菌感染使用抗生素治疗带来了巨大的挑战。

综上，鼠伤寒沙门菌是昆明市地区儿童非伤寒沙门菌感染的主要病原体，菌株间较高的同源性提示患者有相同暴露源的可能，耐药基因blaCTX⁃M3/6、blaTEM、及blaOXA1是造成菌株多重耐药的主要原因之一。关于儿童感染非伤寒沙门菌的主要感染途径，菌株的来源等，有待进一步流行病学研究调查。