高效液相色谱法测定苹果幼果中根皮苷含量

董梅，韩金龙，徐颖，郭莉君，武琴园，罗叶丽

1. 渭南市食品药品检验所（渭南 714000）；2. 陕西科技大学食品与生物工程学院（西安 710021）

苹果根皮苷是苹果中活性最高、含量最多的多酚物质[1]。它主要存在于苹果树的根皮、茎、嫩叶以及苹果果实中，具有多种生物活性[2-5]。近年来被广泛应用于人体药物和生物膜的生理研究，主要包括肥胖症、高血压、抗氧化性、膜渗透性、食品和饮料的保质期、食品添加剂、药物和化妆品等方面[6-9]。

目前根皮苷的检测大多集中在海棠、荔枝、多穗柯甜茶和苹果芽中[10-12]，对于苹果幼果期，果肉、果皮和幼叶中根皮苷检测方法的报道很少。多酚物质的检测常用高效液相色谱法，试验拟建立二极管阵列-高效液相色谱法测定苹果幼果中的根皮苷，分析不同品种、不同组织中根皮苷含量的差异，为苹果的育种优化、提高苹果品质研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果幼果采自陕西白水苹果试验站，包括富士、秦阳、秦冠、红星、红盖露、中秋王、金世纪、黄元帅、洼里红、短枝10个品种，采摘时间2020年6月20日，采摘后放在-20 ℃冰箱保存；根皮苷标品（含量≥98%），上海源叶生物科技有限公司；甲醇（色谱纯），德国默克；乙醇（分析纯），天津科密欧化学试剂有限公司；乙睛（色谱纯），美国天地。

1.2 仪器与设备

ES 225SM-DR分析天平（瑞士Presice公司）；LC-2030 3D高效液相色谱仪（日本岛津公司）；XB320M型电子天平（上海天美）；KQ5200DE数控超声波清洗器（昆山舒美）；砂芯过滤装置（天津津腾）；0.45微孔滤膜（天津津腾）；RE-52A型旋转蒸发器（上海亚荣）。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制（287.2 mg/L）

准确称取7.18 mg标准品，用甲醇溶解并定容至25 mL棕色容量瓶中，在-20 ℃冰箱中储存备用，使用时根据需要稀释成相应质量浓度，过0.45 μm滤膜后进样。

1.3.2 样品的制备

苹果削皮，果皮分离，准确称取1.00 g苹果皮和苹果肉放置在研钵中，加入少量抗坏血酸以防止氧化，研碎，用30 mL体积分数75%的乙醇溶液转移到100 mL的三角瓶中，超声提取30 min，过滤后滤渣再次加入20 mL体积分数75%的乙醇溶液超声提取30 min。合并两次滤液，在38 ℃条件下旋转减压蒸干，用甲醇溶解残留物并定容至10 mL棕色容量瓶中，过0.45 μm滤膜，根据保留时间定性，外标法定量。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：水-乙睛=70∶30（V/V）；柱温：30 ℃；流速1.0 mL/min；进样量：20 μL；检测器：二极管阵列检测器；波长：190～400 nm。

1.3.4 标准曲线的建立

准确吸取不同体积的标准溶液（287.2 mg/L），配制成5个不同质量浓度的标准样品，分别是14.36，28.72，71.8，143.6和287.2 μg/mL，进样20 μL，同一质量浓度的溶液连续进样3次，记录峰面积，取平均值。以峰面积为纵坐标，根皮苷的含量为横坐标做标准曲线。

1.3.5 最低检测限和定量限的测定

将一定质量浓度的标准溶液逐级稀释，依次进样，当信噪比等于3时所对应的标准溶液的质量浓度为检测限，当信噪比等于10时所对应的标准溶液的质量浓度为定量限。

1.3.6 精密度和回收率

按照“1.3.2 样品制备”方法，以富士叶片为原料，经制备得到样液，进样20 μL，重复测定6次，计算根皮苷含量，计算平均值和相对标准偏差（SRSD）。吸取一定质量浓度的根皮苷标准品溶液添加到苹果芽提取液中，进液相色谱检测，计算根皮苷回收率，并做空白对照。

2 结果与分析

2.1 分离条件的优化

为了获得较好的峰形，试用了不同的流动相和检测波长，最终确定的流动相为水-乙睛=70∶30（V/V），检测波长275 nm，在这个条件下根皮苷标准品的色谱图和光谱图如图1所示，根皮苷的保留时间为6.847 min。

图1 根皮苷色谱图（a）和光谱图（b）

2.2 标准曲线、检测限和定量限

以峰面积（y）为纵坐标，标品质量浓度（x）为横坐标，进行线性回归，建立回归方程：y=33 902.8x- 7 343.45，R2=0.999 9，线性范围在14.36～287.2 μg/mL，结果表明，在该试验条件下，标品的质量浓度与其峰面积线性关系良好。按照信噪比等于3计算出检测限，结果为1.16 mg/kg；按照信噪比等于10计算出定量限，结果为3.83 mg/kg。

2.3 精密度检测

以富士叶片为原料，经制备得到样液，进样20 μL，重复测定6次，其中根皮苷含量的平均值和相对标准偏差（SRSD）结果见表1。SRSD为0.87%，说明精密度良好。

表1 精密度检测结果（n=6）

2.4 加标回收率测定

精确吸取0.2，0.5和1.0 mL质量浓度为287.2 μg/mL的根皮苷标准品溶液加入到富士果皮中，按照1.3.2节的方法进行提取分离上机分析，计算加标回收率，结果如表2所示。

表2 根皮苷的加标回收率结果

2.5 样品测定

按照1.3.2节对样品进行前处理，并进液相色谱进行分析，每个样品进样3次，取平均值，富士、秦阳、秦冠、红星、红盖露、中秋王、金世纪、黄元帅、洼里红、短枝的不同品种的叶片、果皮和果肉中根皮苷含量如图2所示。

图2 10个品种苹果不同组织中根皮苷含量

由图2可以看出，10种苹果不同部位根皮苷含量有很大区别，叶片的含量比果肉和果皮都高。洼里红的叶片中含量最高，它的果肉和果皮中也有较高的含量。红星果肉和果皮中含量最高，金世纪叶片、果皮和果肉含量最低，但因为它是早熟品种，也被果农接纳。

3 结论

建立了苹果组织中根皮苷的二极管阵列-高效液相色谱检测方法，采用的流动相为乙睛和水，该方法线性范围为14.36～287.2 μg/mL，相关系数R2=0.999 9，检测限为1.16 mg/kg，定量限为3.83 mg/kg，回收率为98.48%。该方法采用等度洗脱程序，时间少，分析快，线性范围较广，准确可靠，重复性好，可用于苹果组织中根皮苷的检测[13]。

利用该方法分析了富士、秦阳、秦冠、红星、红盖露、中秋王、金世纪、黄元帅、洼里红、短枝10种苹果幼果中根皮苷的含量。结果表明不同品种根皮苷含量有很大区别。叶片中的含量明显高于果肉和果皮。洼里红的叶片中含量最高，它的果肉和果皮中也有较高的含量。红星果肉和果皮中含量最高，金世纪叶片、果皮和果肉含量最低。苹果叶片根皮苷含量随着生长周期不同而发生变化[14]，研究苹果采摘后叶片中的含量，对于开发苹果副产物的综合利用具有广阔前景和价值，以苹果叶作为提取根皮苷的原料，提取高效、安全、无毒的抗氧化性物质，在开发食品抗氧化剂的研制及应用方面具有较好的应用前景。