饲养密度对蛋鸭血清免疫、抗氧化指标及应激反应的影响

王金辉，邓紫璇，黎颂超，张续勐，李婉雁，沈 栩，黄运茂，江丹莉*

（1.仲恺农业工程学院 动物科技学院，广东广州 510225；2.广东省水禽健康养殖重点实验室，广东广州 510225）

我国是蛋鸭养殖和消费大国，南方地区蛋鸭养殖多以传统的水域放牧（半放牧）或大棚地面饲养为主要模式，养殖密度和群体规模至今仍无标准，为追求更高的生产效益，农户不断扩大饲养密度，然而过度增加饲养密度不仅会影响家禽的生产性能，还会引起应激反应并降低动物福利，造成一定的经济损失。研究表明，饲养密度和群体过大会导致禽舍内拥挤，加剧家禽的环境竞争压力，引起互相挤压、采食不均，造成机体应激反应，使家禽不安和恐惧，导致死亡率上升。张璐爽等对北京鸭笼养密度的研究发现，高饲养密度会加强北京鸭免疫系统的代偿反应，并使脾脏萎缩，而中饲养密度使北京鸭体内的氧化应激水平增加。贺卫华等研究发现，高密度养殖不仅降低黄羽肉鸡的抗氧化和免疫能力，还造成肌酸激酶（CK）活性、皮质酮、热休克蛋白70等应激指标上升，对肉鸡的生长和免疫造成不利影响。

长期以来，对饲养密度的探究多以肉鸡和肉鸭为模型，极少聚焦于蛋鸭饲养密度的研究，尤其是对育成期和初产期蛋鸭的饲养密度探究更是鲜有报道。因此，本试验通过研究不同饲养密度对育成期蛋鸭血清免疫、抗氧化指标及应激反应的影响，以期获得适宜的饲养密度范围，为蛋鸭的科学饲养管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计 本试验所用育成期山麻鸭蛋鸭，由仲恺农业工程学院钟村养殖基地提供。选取180只饲养水平和体重一致的健康7周龄山麻鸭蛋鸭，随机分为低密度（n=30）、中密度（n=60）和高密度（n=90）3组，于3个饲养条件相同的半开放式鸭棚中进行“水陆-平养”。鸭舍内分布如下，鸭棚:运动场:水池=6 m:6 m:3 m，即低密度、中密度、高密度3个试验组的舍内密度分别为5、10、15 只/m。每日08:00—18:00为鸭群在运动场和水池自由活动时间。试验期间蛋鸭严格按照生产日粮饲喂，日粮组成及营养水平见表1，严格控制每组的料槽和饮水器个数，保证所有鸭的料位和饮水面积相同，限食不限水，其他条件均按照常规饲养规程执行。试验预试期1周，正试期11周。

表1 基础日粮组成及营养水平(风干基础)

1.2 器官指数测定 于蛋鸭11周龄和19周龄时对所有蛋鸭进行称重，每组随机挑选6只鸭翅下采血后剖杀并采集肝脏和脾脏，称重后计算器官指数，器官指数=器官重（g）/体重（g）×100%。

1.3 血清指标测定 于蛋鸭11周龄和19周龄时，每组挑选6只鸭进行翅下采血，并于室温下静置2 h后3 000 r/min 离心5 min，取血清于-20℃冻存备用，总蛋白、白蛋白、免疫球蛋白A（IgA）和超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所。促肾上腺皮质激素（ACTH）和皮质酮（COR）激素水平利用Elisa方法测定，试剂盒均购自武汉华美（Cusabio）生物工程有限公司。球蛋白浓度=总蛋白浓度-白蛋白浓度。

1.4 RT-PCR分析 于蛋鸭11周龄和19周龄时，每组挑选6只鸭采集下丘脑和垂体。用Trizol 法提取下丘脑和垂体总RNA，使用Toyobo东洋纺反转录试剂盒进行反转录，合成的cDNA置于-20℃保存备用。参照GenBank中鸭或近缘物种相关基因的mRNA序列，使用NCBI的Primer Blast网站设计促肾上腺皮质激素释放激素基因（），糖皮质激素受体基因（）、促肾上腺皮质素释放激素受体2基因（）、阿片促黑素皮质素原基因（）和内参的荧光定量引物（表2），送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以反转录获得的cDNA为模板，按照SYBR Green PCR Master Mix荧光定量试剂使用说明书配制20 μL 反应体系，进行实时荧光定量检测。PCR反应 体 系20 μL：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上 下 游 引 物 各0.5 μL（10 µmol/μL），ddHO 8 μL，cDNA 1μL。PCR反应条件：95℃ 1 min，95℃ 10 s，58℃ 30 s，40个循环，每个样品设3次重复。

表2 引物序列

1.5 统计分析 荧光定量PCR扩增数据采用2法进行处理。试验数据均使用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，组间差异显著性采用LSD多重比较法进行检验，结果用平均数±标准误表示，<0.05表示差异显著，>0.05表示差异不显著。

2 结果

2.1 饲养密度对蛋鸭体重和免疫器官指数的影响 表3结果显示，11周龄和19周龄时低密度组蛋鸭体重均高于中密度组和高密度组（<0.05）；11周龄时，3组间脾脏和肝脏指数均无显著性差异；随着饲养时间的增长，19周龄时脾脏指数和肝脏指数均为高密度组>中密度组>低密度组（<0.05）。

表3 饲养密度对体重和器官指数的影响

2.2 饲养密度对蛋鸭体液免疫指标的影响 表4结果显示，11周龄时，高密度组的白蛋白浓度低于低密度组和中密度组（<0.05），总蛋白、球蛋白和IgA浓度没有差异；19周龄时，中、高密度组的白蛋白浓度低于低密度组（<0.05），而球蛋白和IgA浓度高于低密度组（<0.05），中密度与高密度组间差异不显著。

表4 饲养密度对体液免疫指标的影响 g/L

2.3 饲养密度对蛋鸭抗氧化指标的影响 表5结果显示，11周龄时，中密度和高密度组血液SOD浓度低于低密度组（<0.05），3组间T-AOC浓度差异不显著；19周龄时，中密度组的SOD低于低、高密度组（<0.05），中、高密度组的T-AOC浓度低于低密度组（<0.05）。

表5 饲养密度对抗氧化指标的影响

2.4 饲养密度对蛋鸭应激基因表达水平的影响 图1结果显示，11周龄时，不同饲养密度对蛋鸭的基因的相对表达水平影响不显著，但饲养至19周龄时，高密度组的相对表达量高于低、中密度组（<0.05），基因的相对表达量高于低密度组（<0.05）。

图1 饲养密度对蛋鸭应激相关基因表达的影响

2.5 饲养密度对蛋鸭激素水平的影响 图2结果显示，11周龄和19周龄蛋鸭的ATCH水平差异均不显著，但19周龄高密度组的ATCH 水平较低密度组和中密度均有所有上升；11周龄蛋鸭组间的COR水平差异不显著，19周龄中、高密度组的COR水平高于低密度组（<0.05）。

图2 饲养密度对蛋鸭应激激素水平的影响

3 讨 论

3.1 饲养密度对体重及免疫器官指数的影响 本研究结果表明，试验期间，随着饲养密度增加，蛋鸭体重呈下降趋势，免疫器官指数也受到相应的影响。免疫器官指数是反映机体免疫器官生长发育的重要指标，可用来评定家禽的免疫水平。肝脏具备抗氧化、解毒及抗凝血等功能，由肝脏合成的血清总蛋白在代谢旺盛时可促进动物机体生长和发育，而脾脏与免疫息息相关，几乎参与机体内所有的免疫应答。本试验发现，随着饲养密度增加，鸭肝脏指数呈递增趋势，与以往的研究结果一致。高密度饲养方式导致动物长期受应激，在ACTH的持续刺激下，肝脏脂肪酸的合成增加，加强了肝脏脂肪沉积，从而导致肝脏肥大，最终表现出肝脏指数显著增加。本研究中，中、高密度组的脾脏指数在11周龄时均略低于低密度组，而19周龄时随着密度的增加，脾脏指数呈显著上升趋势，其原因可能是随着饲养密度升高，蛋鸭在高饲养密度情况下应激增大，免疫机能减弱，免疫性能受到影响，早期呈现出脾脏指数下降，但后期由于应激加剧，导致肝脏损伤，最终使脾脏代偿性增大，免疫功能受损。

3.2 饲养密度对体液免疫指标的影响 本试验中，随着饲养密度增加，血清白蛋白浓度下降，而球蛋白和IgA浓度上升。血清白蛋白浓度下降可能是由于较高的饲养密度导致肝功能受损，肝细胞产生白蛋白的能力下降。血清中免疫球蛋白大部分在肝细胞外生成，与机体免疫力相关，其中Ig A是抗炎性反应中重要的免疫球蛋白，球蛋白和IgA含量的增加表明了机体免疫系统受到损伤，这意味着高饲养密度会影响机体的免疫应答和免疫功能。

3.3 饲养密度对抗氧化指标的影响 SOD可有效清除体内过多的超氧阴离子（O），具有保护内皮细胞的功能，是机体清除自由基的第一道防线，而T-AOC可反映机体非酶促抗氧化能力的大小，是抗氧化系统功能状况的综合指标。在整个试验期内，随着饲养密度的增大，蛋鸭血清中SOD水平均显著降低，而T-AOC水平也于19周龄时出现显著降低，其主要原因可能是增大饲养密度会引起群体秩序混乱，刺激群体间的争斗，导致动物体内产生过多的自由基，使机体抗氧化系统受到损伤。

3.4 饲养密度对应激反应的影响 动物受到内外环境刺激时，会引起下丘脑室旁核神经元分泌和释放CRH，CRH与靶细胞上的受体结合后，激活下丘脑-垂体-肾上腺轴，增加基因的表达，促进ACTH的分泌和释放，进而引起血液循环中的糖皮质激素水平变化。COR是主要的糖皮质激素，垂体分泌的ACTH通过血液作用于靶细胞可促进COR的分泌。当机体处于应激状态时，机体会合成并分泌大量COR，以增加机体抵抗应激的能力。本研究发现，随着饲养密度增大，和相对表达量增加，血清中的ACTH和COR水平升高，且在19周龄时表现得更为明显。这与以往研究结果相一致，即加大群体数量和高饲养密度会导致家禽的应激，糖皮质激素水平升高。

免疫功能系统、神经系统和内分泌系统是相互交叉互相作用的，这些系统可以产生双向信号，将信号传递给中枢神经系统和下丘脑系统，急性应激对免疫功能的影响并不明显，但是长期的慢性应激将损害机体的免疫功能进而影响着机体的生长。因此，生产上应重视高饲养密度所引起的长期的综合性的应激反应。增加饲养密度会引起机体应激反应，从而可能会影响机体的免疫功能和抗氧化功能，进而影响整个机体的免疫状态。

4 结 论

本试验结果显示，在水陆-平养饲养模式下，增大饲养密度会抑制蛋鸭的生长性能，影响机体免疫和氧化指标，高饲养密度所带来的应激会导致的体组织分解代谢及氧化损伤，同时影响免疫应答和免疫功能。综合育成期及初产期蛋鸭血清免疫指标、抗氧化指标及应激相关激素、相关基因表达的结果，建议水陆-平养饲养模式下，蛋鸭由育成期转为初产期分群时，舍内饲养密度应控制在5～10只/m。