光照时间对就巢期浙东白鹅血清生理生化指标、盲肠挥发性脂肪酸和肠道菌群的影响

2022-02-20徐中宝陈思颖颜菲菲赵阿勇

中国畜牧杂志 2022年2期

徐中宝，马辉，陈思颖，颜菲菲，赵阿勇

（浙江农林大学动物科技学院动物医学院，浙江临安 311300）

光周期指昼夜周期中昼夜长短的交替变化，是鸟类重要的环境影响因子，调控着鸟类的生物节律。在自然条件下，鸟类的繁殖行为呈现出季节性，即在繁殖季节才开始繁殖行为，如产卵、就巢、孵卵等。产蛋后，鸟类会蹲伏在巢内孵蛋，饮食行为减少、体温降低和新陈代谢减慢。就巢时期，盲肠被认为是降解日粮中纤维物质的主要消化器官。盲肠中的微生物降解纤维和酵解未消化的物质，产生乙酸、丙酸和丁酸等挥发性脂肪酸（Volatile Fatty Acids，VFA），为肠黏膜细胞提供能量、降低肠道pH，促进益生菌的生长增殖和抑制病原菌的定值等。影响肠道微生物和VFA的因素包括日粮、年龄和饲养方式等，但光照的研究较少。

浙东白鹅是季节性繁殖动物，其强就巢性限制了产蛋性能。在动物生产中，可利用光照来调控鹅的繁殖行为。前期研究发现，短光照（9L:15D）会显著缩短浙东白鹅的就巢期，提高产蛋量及其在就巢期的采食次数和体重。因此，本研究主要探索光照时间对就巢期浙东白鹅的血清生理生化指标、盲肠VFA含量以及肠道微生物的丰度和多样性的影响，为光照时间调控鹅的产蛋和就巢性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计选取来自于浙江宁波象山浙东白鹅原种场的16只健康浙东白鹅母鹅，所有试验鹅均为220日龄，且体重相近，随机分为2组，每组6个重复。长光照组每日给予15 h光照（04:00—19:00），短光照组每日给予9 h光照（08:00—17:00）。用黑色记号笔标记个体，两组饲养管理条件相同，每天固定时间（08:00和17:00）喂食2次，日粮组成及营养成分见表1。试验时间为2018年11月15日—2019年1月16日。

表1 试验日粮组成及营养成分（风干基础）

1.2 样品采集试验结束后，翅下采集静脉血，常温静置待血液凝固后，4℃，5 000 r/min离心5 min，取上清，-80℃保存备用。解剖试验鹅，采集鹅盲肠内容物于2 mL冻存管中，迅速放入液氮。-80℃保存备用。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 血清生理生化指标检测血清冰上解冻后，采用A6半自动生化仪（北京松上技术有限公司）测定血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、胰岛素（INS）、胰淀粉酶（PAMY）和脂肪酶（LIP）活力以及血清总胆红素（TBIL）、间接胆红素（IBIL）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、尿素（UREA）、葡萄糖（GLU）、总胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、钙（Ca）和无机磷（PHOS）含量，检测试剂盒购于宁波普瑞柏生物技术股份有限公司。

1.3.2 盲肠挥发性脂肪酸含量检测准确称取0.5 g盲肠内容物，加入1 mL ddHO，漩涡振荡混匀，4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清。按上清液:25%偏磷酸为10:2（mL）的比列加入25%的偏磷酸，混合均匀，冰浴30 min。4℃、12 000 r/min离心10 min。0.22 μm滤膜过滤上清液。采用安捷伦7890B气相色谱仪测定乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸含量。

1.3.3 肠道微生物组成肠道微生物委托广东美格基因科技有限公司进行16S rRNA 测序分析及数据处理，根据97%的相似度对序列进行操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTU)聚类，对生成的OTU信息进行细菌群落多样性和丰富度分析，计算richness、Chao1、Shannon和Simpson等多样性指数，绘制稀释曲线。对OTUs在门属水平上的物种相对丰度分析，分析门属水平分布和差异菌群。

1.4 统计分析所有数据采用IBM SPSS Statistics 22.0进行K-S检验（Kolmogorov-Smirnov test），分析数据正态性。符合正态分布的数据采用T检验，非正态分布的数据采用曼-惠特尼秩和检验（Mann-Whitney U test），以分析数据组间差异显著性。显著性水平设置为=0.05，统计值用平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 光照时间对血清生理生化指标的影响由表2可知，长光照组的ALP、IBIL和Ca低于短光照组（<0.05），LIP高于短光照组（<0.05），其他指标差异不显著。

表2 光照时间对血清生理生化指标的影响

2.2 光照时间对盲肠VFA含量的影响由表3可得，长光照组的6种VFA均高于短光照组，其中乙酸、丙酸、异丁酸和异戊酸含量无显著差异，丁酸和戊酸差异显著。

表3 光照时间对浙东白鹅盲肠VFA含量的影响 μmol/g

2.3 光照时间对肠道微生物的影响

2.3.1 测序情况和OTUs分析对测序结果质控后的数据进行优化整理，每个处理组的数据统计结果见表 4，两组间OTUs数量和序列碱基个数差异不显著。97% 相似度下样品取样深度的稀释曲线见图1，当样品随机抽取的数据量为66%左右时，曲线开始趋于平坦，说明测序深度足够。

图1 稀释曲线图

表4 样本测序数据统计结果

2.3.2多样性分析由表5可知，光照时间对肠道菌群richness指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数均无显著性影响。

表5 光照时间对浙东白鹅肠道菌群α多样性指数的影响

2.3.3 菌落结构 2组肠道菌群共19个门类，主要由拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、螺旋体门（Spirochaetes）和蓝细菌门（Cyanobacteria）组成（见图2、3）。其中短光照组未检测到异常球菌属-栖热菌门（Deinococ cus-Thermus），长光照组未检测到广古菌门（Euryarc haeota）。与短光照组相比，长光照组的黏胶球形菌门（Lentisphaerae）显著降低，其他门类差异不显著。两组肠道菌群共检测到171个属，主要由瘤胃菌科_UCG-009（Ruminococcaceae_UCG-009）、属、史雷克氏菌属（）、密螺旋体属（）、属、属、脱硫弧菌属（）、属和属等属组成。

图2 肠道微生物在门水平的分布

其中，极地杆菌属（）、交替单胞菌属（）、伯克氏菌属（）、卡斯特兰尼氏菌属（）、代夫特菌属（）、属、属、甲基杆菌属（）、马赛菌属（）、甲烷短杆菌属（）、甲烷球形菌属（）、嗜甲基菌（）、属、属、血杆菌属（）和四圆形菌属（）共16个属只在短光照组检测到；漠河杆菌属（）、特吕珀菌属（）、属、嗜盐单胞菌属（）、内芽孢杆菌属（）、属、属、弓形杆菌属（）、属、属和属共11个属只在长光照组检测到。

与短光照组相比，长光照组的短杆菌属（）、甲基杆菌属（）、嗜甲基菌（）、属、属和属显著降低，而乳杆菌属（）显著上升，具体见表6。

图3 肠道微生物在属水平的分布

表6 光照时间显著影响肠道微生物的门类和属类

3 讨论

3.1 光照时间对血清生理生化指标的影响血液是动物循环系统的重要组成部分，具有物质运输、体液调节和内环境稳态等功能。血液的生理生化指标是反映动物机体的物质代谢和组织器官机能的重要指标。血清中TP、ALB和GLO与CHOL和TG分别反映机体蛋白质代谢水平和脂类代谢水平。UREA是动物体内氨基酸代谢的终产物，血清UREA浓度反映机体蛋白质代谢水平。GLU是生命体的主要功能物质，也是糖代谢的产物和蛋白质、脂质代谢的原料。INS调控葡萄糖代谢和脂质、蛋白质合成代谢。本研究中，长光照组和短光照组的TP、ALB、GLO、CHOL、TG、GLU和INS差异不显著，说明光照时长不影响蛋白质、脂质和葡萄糖代谢。潘栋、何松研究发现长光照提高蛋鸡血清TP、GLO、GLU和TG含量和绿尾虹雉血清CHOL、TG含量。这可能与饲养模式有关。蛋鸡和绿尾虹雉采食量随光照时间增加而增加，但笼养模式限制其活动而降低物质消耗，而本研究中浙东白鹅在平养模式下饲养，短光照组的采食次数增加，站立行为和踱步行为时间也增加。

LDH、转氨酶和胆红素是检验肝功能的重要指标。转氨酶主要存在于肝组织细胞中，当肝细胞受损，细胞膜通透性增加，转氨酶会释放到血液中。衰老红细胞的血红蛋白衍化成动物血液中的胆红素，胆红素与血液中的血浆白蛋白结合形成IBIL。因此，当红细胞或肝功能受损时，血清中胆红素含量升高。UREA是动物体内氨基酸代谢的终产物，经肾脏排泄出体外。血清中UREA是检验肾功能的重要指标。CK主要存在于肌肉细胞的线粒体中，与ATP再生和有氧代谢有直接关系。当肌肉组织损伤时，肌肉细胞膜通透性增加，CK释放到血液中，使血清CK活性上升。血清CK活性是检验骨骼肌损伤的重要指标。本研究中，长光照组和短光照组的ALT、AST、UREA和CK无显著差异，光照时长不影响就巢期浙东白鹅肝、肾和骨骼肌功能；短光照组IBIL显著上升，可能是因为红细胞受损导致。血清LIP和PAMY是检验胰腺功能的重要指标。本研究中，两组间PAMY无差异，而长光照组LIP显著上升，说明长光照影响胰腺功能。

陈冬梅等研究发现，血清中ALP、Ca和PHOS与家禽产蛋性能有关。Ca是影响骨骼发育和蛋壳形成的关键因子。蛋壳形成所需的碳酸钙前体来源于血液中的钙离子，缺钙会出现产蛋量减少，而高水平的血钙浓度促进蛋壳的形成，提高产蛋量。ALP由成骨细胞和肝脏分泌，与骨代谢关系密切。血清ALP水平升高表示成骨细胞活性提高，骨质生成旺盛，骨中钙、磷的沉积增加。研究表明血清ALP与PHOS呈负相关，血液PHOS降低会使骨骼ALP释放量增加，使Ca在骨组织沉淀。Ca和PHOS满足机体需要能够提高肉鸡的生产性能和胫骨质量。杨伟平等研究显示鸭的血清ALP与产蛋量呈正相关。本研究中，长光照组和短光照组血液PHOS无差异，说明血清ALP活力上升不是由于缺PHOS引起的。ALP活力和血钙浓度提高说明短光照有助于浙东白鹅的产蛋性能和骨质生长，这与前期研究结果相一致，即短光照缩短浙东白鹅就巢期，提高了产蛋量。但Cui等研究发现252日龄金定鸭蛋鸭血清ALP、蛋壳强度和骨强度随着光周期的增加而增加。12-20 h光照的光周期中，18L:6D的血清ALP、蛋壳强度和骨强度最高。另外，何松发现16L:8D能提高繁殖期绿尾虹雉血清ALT、AST、Ca、PHOS、CHOL和TG等含量和产蛋量。这些研究结果的差异与动物自然繁殖期的光周期有关。短光照促进短日照繁殖性禽类繁殖，长光照则抑制其繁殖。如绿尾虹雉繁殖期从3—4月开始，日照时间逐渐增长；而浙东白鹅繁殖期在11月至次年4月，日照时间短，所以短光照提高血清Ca浓度以促进浙东白鹅产蛋。另外，血清ALP活力在一定程度上反映生长速度，这也与短光照提高浙东白鹅采食量和体增重的结果相符。

3.2 光照时间对盲肠VFA含量的影响 VFA由盲肠或结肠中的微生物发酵碳水化合物产生，包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸和异己酸。乙酸、丙酸和丁酸大约占VFA的85%。本试验中，长光照组的的丁酸和戊酸含量显著高于短光照组。丁酸主要在大肠（盲肠和结肠）中产生和作用，为肠道有益菌和上皮细胞提供生长能量以及良好的环境。丁酸能促进肠道上皮细胞的组织和再生，改善肠道形态，减少家禽肠内病原菌的定植和有利于保持肠绒毛结构。戊酸盐可增强丙酮酸氧化和乙酰辅酶a生成，诱导IL-10分泌，通过T和B淋巴细胞代谢改善小鼠肠道和大脑中T细胞介导的免疫病理学。前期结果表明，长光照可提高浙东白鹅血浆中IL-10含量，说明长光照可能通过盲肠中戊酸的生成促进血液中IL-10含量，提高浙东白鹅就巢期的免疫能力。

3.3 光照时间对肠道微生物的影响肠道微生物有辅助营养吸收、物质代谢，推进机体发育以及维持宿主健康的功能。在机体的免疫防御功能中，肠道微生物不仅可以增强肠道黏膜屏障，还能够调节宿主的整体免疫，从而有效抑制病原微生物的威胁。本试验中，长光照组和短光照组之间肠道菌群richness指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数均无显著变化，表明光照时间对就巢期浙东白鹅肠道微生物物种丰度和多样性无显著性影响。杨博研究表明光照时间对蛋鸭肠道微生物无决定性影响。

短杆菌属（）具有很强的蛋白水解能力，能够进行氨基酸代谢，如利用天冬氨酸合成苏氨酸和赖氨酸。嗜甲基菌属()具有降解纤维素和芳香族化合物功能。食物谷菌属（）是黏胶球形菌门（Lentisphaerae）的菌属。日粮中纤维素和支链氨基酸能增加肠道食物谷菌属（）的相对丰度。研究发现短光照组的浙东白鹅体增重增加，可能因为采食频率提高，盲肠中菌群代谢底物的增加提高了短杆菌属（）、嗜甲基菌属（）、食物谷菌属（）的相对丰度，促进物质消化吸收。但采食和饮水频次增加，盲肠内容物中VFA浓度被稀释，致使短光照组VFA浓度具有下降趋势。乳杆菌属（）可以使肠道处于酸性环境，与肠上皮细胞形成生理屏障，拮抗病原菌的侵袭和定植。乳杆菌属还能调节焦虑行为和治疗肠易激综合征。长光照组的乳杆菌属（）相对丰度增加有助于肠道健康。目前，其他相对丰度具有显著差异的菌群研究较少。肠道微生物的多样性受食物、季节、物种等因素影响，与肠道挥发性脂肪酸等内容物相互影响。本研究中，光照时间对浙东白鹅肠道菌群结构无影响，长光照使盲肠内容物中丁酸、戊酸含量和乳杆菌属增加，短光照使代谢纤维素和氨基酸的菌属增加。目前，光照时间影响肠道微生物的研究较少，有待进一步研究。