不同光照制度对奶牛褪黑素分泌的影响

荆林娜，段 涛，刘胜寒，解东祥，段月岩，张 微

（中国农业大学动物科学技术学院，动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

褪黑素是由动植物体内的色氨酸在一系列酶的催化下生成的一种吲哚类激素，具有改善睡眠、抗氧化、抗衰老和调节免疫等功能。睡眠障碍是当今时代尤为突出的健康问题，为了解决这一问题，人们开始服用以褪黑素为有效成分的保健品。现在市场上的褪黑素以化工合成为主，纯度较高，但其安全性问题备受关注，因此开发富含天然褪黑素的食品具有重要意义。

牛奶中含有天然的褪黑素，又是当今大众消费最多的乳制品，因此开发富含天然褪黑素牛奶的市场前景广阔。有研究指出，饮用富含褪黑素的牛奶在夜间能够帮助儿童形成出生时尚未充分发育的日常生活节律，可以改善老人的睡眠质量，增加日间活动，对于年轻人也可以从喝牛奶中受益。Voltonen等研究了富含天然褪黑素的夜间牛奶对患痴呆症老年人的影响，发现低剂量的褪黑素（不影响体内正常褪黑素的分泌）也能够增加老年人的日间活动，但是由于是在不同季节进行的试验，因此季节原因对于试验结论影响很大。调查发现普通市售牛奶中褪黑素含量较低，因此生产富含天然高褪黑素的牛奶成为当今时代的需求。芬兰、德国、英国和中国都已经针对天然高褪黑素牛奶的生产发明了专利。本试验在以上专利文献的基础上研究了16 h光照8 h黑暗和8 h光照16 h黑暗2种光照制度对奶牛褪黑素分泌的影响，为天然高褪黑素奶的生产提供参考。

1 试验方法

1.1 试验时间及地点 于2018年12月—2019年1月进行16 h光照处理的试验；于2019年4月—2019年5月进行16 h黑暗处理的试验。试验地点为北京金龙腾达奶牛养殖场。

1.2 试验设计 选择10头健康经产（2～3胎）、泌乳阶段相近（120±40）d的荷斯坦奶牛，每天2次投料，自由饮水，挤奶时间为05:00及17:00，分别设定为夜奶及日奶。试验选择自身对照。试验处理前连续采集2 d奶样并于23:00采集血样作为对照；试验处理第1、6、11、16、21、26、31天采集奶样并采集23:00血样。分离血样以获得血清，将血清及奶样于-20℃冻存用于检测褪黑素浓度。记录每天产奶量。

在16 h光照8 h黑暗处理中，试验牛于17:00挤奶完成后进入密闭牛棚，并打开全光谱日光灯，保证牛棚内各位置光强均大于300 lx；21:00关闭日光灯，牛棚中处于完全黑暗状态，夜间人工操作使用红色LED灯作为光源，牛只眼睛处光强不超过2lx；05:00挤奶完成后将试验牛赶入密闭牛棚，打开日光灯；09:00将试验牛赶出牛棚继续接受日光。

在8 h光照16 h黑暗处理中，试验牛于17:00挤奶完成后进入密闭牛棚，保证牛棚内全黑，夜间人工操作使用红色LED灯作为光源，牛只眼睛处光强不超过2 lx；05:00挤奶完成后将试验牛赶入密闭牛棚；09:00将实验牛赶出牛棚继续接受光照。

1.3 样品前处理及测定 首先对血清样和奶样进行解冻，血清样解冻之后可以直接进行褪黑素浓度的测定；在测定奶样时，首先采用高速离心机（德国产D-37520 Osterode am Harz）对其进行脱脂处理，4℃下4 000×g离心15 min。所有样品褪黑素浓度检测采用德国IBL公司ELISA试剂盒（RE54021），检测过程遵循试剂盒说明书。

1.4 统计分析 数据采用Excel 2007进行初步整理，然后采用SPSS 19.0进行单因素方差分析，<0.05为差异显著。采用Graphpad Prism8进行折线图绘制，折线图中误差的大小用标准误来表示。

2 结果

2.1 16 h光照处理对奶牛褪黑素分泌的影响

2.1.1 16 h光照处理对奶牛血清褪黑素浓度的影响 由图1可知，处理前2 d的平均褪黑素浓度为20.49 pg/mL，处理后在18.97 pg/mL上下波动。16 h光照处理对血清褪黑素浓度无影响，处理1个月内各采样时间点血清褪黑素浓度无差异。

图1 16 h光照处理对奶牛23:00血清褪黑素浓度的影响

2.1.2 16 h光照处理对日奶及夜奶中褪黑素浓度的影响 由图2可知，日奶在处理前褪黑素浓度最高达到4.71 pg/mL，随着处理时间延长，日奶褪黑素浓度显著降低，处理后最低为2.18 pg/mL。由图3可知，夜奶褪黑素浓度处理前后差异不显著，处理前褪黑素浓度平均为6.63 pg/mL，处理后在6.60 pg/mL上下波动。所以16 h光照处理对日奶中褪黑素浓度的影响较夜奶更为明显。

图2 16 h光照处理日奶中褪黑素浓度的变化

图3 16 h光照处理夜奶中褪黑素浓度的变化

2.2 16 h黑暗处理对奶牛褪黑素分泌的影响

2.2.1 16 h黑暗处理对奶牛血清褪黑素浓度的影响 由图4可知，处理前2 d的平均褪黑素浓度为27.03 pg/mL，随着天数增加，血清褪黑素浓度有升高趋势，最高达到30.92 pg/mL。16 h黑暗处理对血清褪黑素浓度无影响，在处理的1个月内，各采样时间点血清褪黑素浓度无差异。

图4 16 h黑暗处理对奶牛23:00血清中褪黑素浓度的影响

2.2.2 16 h黑暗处理对日奶及夜奶中褪黑素浓度的影响由图5、6可知，日奶、夜奶中褪黑素浓度均在第6天突然降低。除去第6天，日奶及夜奶褪黑素浓度均在处理第16天以后降低。在处理前，日奶褪黑素浓度平均为3.67pg/mL，处理后最低为2.63 pg/mL；夜奶褪黑素浓度处理前平均为8.72 pg/mL，处理后最低为5.70 pg/mL，16 h黑暗处理对夜奶褪黑素浓度的影响更为明显。

图5 16 h黑暗处理日奶中褪黑素浓度的变化

图6 16 h黑暗处理夜奶中褪黑素浓度的变化

3 讨 论

3.1 光照强度对褪黑素分泌的影响 褪黑素分泌受光照强度的制约，当光照强度超过50 lx时，就会抑制奶牛褪黑素的分泌。但有研究指出，这种光照强度抑制的持续时间较短，一般为2 h，光照强度稍强则持续时间会延长，直至当光照强度超过400 lx时就会抑制夜间时长为8 h的整个过程。因此在实际生产中，生产天然高浓度褪黑素牛奶需要严格控制夜间的光照强度，使奶牛正常分泌褪黑素。Asher等研究发现，与夜间黑暗[光照强度（5.08±0.04）lx]相比，在夜间用光强为（105±3.91）lx的光照时，无论是日奶或夜奶的褪黑素浓度都相对较低。可见在夜间当光照强度超过一定强度时，就会抑制褪黑素分泌。总体来说，严格控制好夜间的光照强度，使奶牛夜间正常分泌褪黑素，在天然高褪黑素牛奶的生产中是非常必要的。本试验中，光照处理时的光照强度大于300 lx，黑暗时的光照强度不超过2 lx，因此夜晚不会抑制褪黑素的分泌。

3.2 日、夜奶分离在天然高褪黑素奶生产中的必要性本试验中，2种光照制度中夜奶褪黑素浓度都显著高于日奶。也有很多研究证实了这一结论，并提出夜间挤奶并实行日、夜奶分离制度是生产天然高褪黑素奶的有效途径。如Eriksson等研究发现牛奶中褪黑素浓度在夜间增加；Romanini等测定了从30头荷斯坦奶牛采集的奶样中的褪黑素浓度，发现夜奶褪黑素浓度高于日奶（14.87±7.69 VS 6.98±3.05 pg/mL）；Milagres等研究发现02:00采的牛奶中褪黑素浓度（39.43 pg/mL）显著高于15:00采的牛奶（4.03 pg/mL）。Castro等测定了12头奶牛24 h血浆和牛奶中的褪黑素浓度，结果表明血浆和牛奶中的褪黑素浓度在暗周期高，在光周期低。与以上研究相比，本试验测得的奶中褪黑素浓度较低，这有可能是褪黑素浓度的测定方法不同造成，另外采奶季节、饲养环境和奶牛状态等因素也会影响褪黑素浓度。

综合以上研究，在实际生产中可以将夜间牛奶与日间牛奶分开储存、加工和商品化生产，这是获得天然高褪黑素牛奶的一种有效途径。

3.3 不同光照制度对牛奶中褪黑素浓度的影响 根据褪黑素的分泌特点，实行光控管理是生产天然高褪黑素奶的重要途径。依照芬兰专利中推荐的光照制度（光照/黑暗为17/7）与之前的光照制度（光照/黑暗为12/12）相比，牛奶中褪黑素浓度从8.9 pg/mL增加到56.4 pg/mL。英国专利中光周期比暗周期长4～8 h，1次挤奶在暗周期结束前进行，暗周期和其他时间内的牛奶分开收集和加工，应用此专利方法生产的牛奶中褪黑素浓度为15～30 pg/mL。德国专利中光周期比暗周期长8～12 h，挤奶在暗周期结束之前进行，用该牛奶加工制作的奶粉中，群体平均的褪黑素含量大于200 pg/g，动物个体能达到500 pg/g以上。我国专利中光周期和暗周期的时长分别为12 h和11.5 h，采奶时间为30 min，应用此专利方法生产的原料乳中褪黑素浓度为50～71 pg/mL。这些专利都对光照制度进行了一定程度的调整，并强调在暗周期结束之前进行挤奶使褪黑素浓度达到一个较高的水平。

在芬兰、英国、德国专利中推荐的方法中，光照时间都超过了12 h，得到的牛奶褪黑素浓度都比较高。与以上专利相比，本试验中16 h光照8 h黑暗处理显著降低了日奶中的褪黑素浓度，对夜奶褪黑素浓度没有显著影响，没有得到与专利一致的结果，这可能是本试验设置的具体光照强度和光的种类与专利方法以及挤奶时间不一致，详细原因有待继续开展相关研究。

4 结 论

本试验中，16 h光照处理对夜间血清和夜奶褪黑素浓度无影响，显著降低了日奶褪黑素浓度；16 h黑暗处理对夜间血清褪黑素浓度无影响，使日奶和夜奶中褪黑素浓度在16 d以后降低，与处理前相比夜奶褪黑素浓度降低较显著。2种光照制度的夜奶褪黑素浓度均高于日奶褪黑素浓度，因此日、夜奶分离是生产天然高褪黑素奶的一种简单有效方法。