苯甲酸和精油组合对肉鸡生长性能、屠宰性能和肠道微生物的影响

2022-02-20楚丽翠吕尊周王正国周桂莲呙于明

中国畜牧杂志 2022年2期

燕磊，楚丽翠，安沙，吕尊周，王正国，周桂莲，呙于明

（1.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193；2.新希望六和股份有限公司，北京 100102；3.山东新希望六和集团有限公司，山东青岛 266061；4.农业农村部饲料及畜禽产品质量安全控制重点实验室，四川新希望六和科技创新有限公司，畜禽饲料与畜产品质量安全控制四川省重点实验室，四川成都 610101；5.帝斯曼维生素（上海）有限公司，上海 201419）

饲料中使用抗生素添加剂对畜禽具有良好的促生长作用，但长期过量使用抗生素会导致耐药性菌株出现，同时造成体内正常菌群失调，严重威胁动物机体的健康。欧洲从2006年开始在饲料中禁止使用抗生素。我国农业农村部发布公告，自2020年7月1日起停止生产含有促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料。因此，绿色环保型养殖新体系成为研究的热点。近年来，研究者发现植物提取物、有机酸等饲料添加剂在改善动物生长和肠道微生物区系以及提高动物机体免疫方面发挥一定作用。苯甲酸作为一种有机酸，适量添加到饲料中具有提高肉鸡增重和饲料转化率的作用。而在饲粮中添加植物精油也有增加动物肠道消化酶的分泌、提高营养物质的吸收率和动物的抗氧化能力、促进动物生长的作用。目前，关于有机酸、精油等单一添加剂对肉鸡生长性能方面的应用研究较多，部分研究报道了二者混合使用的应用效果，但对肠道健康的研究较少。因此，本试验旨在研究有机酸和精油组合对肉鸡生长性能、屠宰性能以及肠道微生物的影响，为绿色环保型肉鸡日粮的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与设计选取540只1日龄罗斯308商品肉公鸡，随机分成3组，每组6个重复，每个重复30只鸡。空白对照组饲喂基础饲粮；抗生素组在空白对照组的基础上添加10 mg/kg维吉尼亚霉素；苯甲酸+精油组在空白对照组的基础上添加300 mg/kg苯甲酸和植物精油混合物[帝斯曼维生素（上海）有限公司]。该混合物为80%苯甲酸和20%精油混合物（有效成分为百里香酚、丁香酚和胡椒碱）。

1.2 试验饲粮试验饲粮及营养水平参照育种公司推荐标准及NRC标准（1994）配制。试验分1～14、15～24、25～37日龄3个阶段，1～14日龄饲喂破碎料，其他阶段均为颗粒料。基础饲粮组成及营养成分见表1。

表1 基础饲粮组成及营养成分（风干基础）

1.3 饲养管理试验鸡采用多层笼养。自由采食和饮水，每日观察鸡群健康情况与精神状况。采用整舍育雏，暖风炉水暖控温，最初进雏时舍温为32℃，以后每周降低2℃，直到26℃为止。按正常免疫程序进行免疫。鸡舍内温度、湿度、光照和卫生学指标符合《商品肉鸡生产技术规程》（GB 19664—2005）。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 生长性能在肉鸡14、24、37日龄时分别对每个重复试验鸡进行空腹称重并统计采食量，以计算日增重（ADG）、日采食量（ADFI）、耗料增重比（F/G）。

1.4.2 屠宰性能及消化器官发育 38日龄，每组随机选择10只鸡，称重后屠宰（下同）。剥离腹脂（包括腹部和肌胃周围的所有脂肪）、双侧胸肌和腿肌、肌胃、腺胃并称重，计算胸肌率、腿肌率以及肌胃、腺胃相对重量（相对于活重的比值）。

1.4.3 免疫器官指数屠宰后摘取法式囊、脾脏称重，计算免疫器官指数。

免疫器官指数（g/kg）=免疫器官重量/体重

1.4.4 肠道菌群结构分析处死后迅速抛开腹腔，取出胃肠道，置于冰上，然后用无菌棉线结扎消化道各段，分离十二指肠、空肠、回肠。立即在冰上无菌条件下取回肠中段食糜，液氮速冻后，用作肠道微生物区系定性、定量分析。

参照基因组DNA提取试剂盒说明书提取回肠食糜中微生物的DNA。用 NanoDrop 2000测定DNA样本的浓度，同时利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样本的纯度。提取好的基因组DNA为模板进行PCR扩增，并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库。将混合好的文库稀释定量后用 Illumina-MiSeq测序仪测定，对序列信息进行操作分类单元（Operational taxonomic unit，OTU）、多样性及差异性分析。

1.5 统计分析数据采用SPSS16.0统计软件中GLM模型以ANOVA方法进行分析。若各个处理间差异显著，则用Duncan′s多重比较进行检验。结果用最小二乘法的平均值表示，<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 苯甲酸和精油组合对肉仔鸡生长性能的影响由表2可见，苯甲酸和精油组合对各阶段肉鸡生长性能无显著影响。苯甲酸+精油组的24日龄体重高于空白对照组（>0.05）；25～37日龄，抗生素组肉鸡耗料增重比最低（1.65）；1～37日龄，抗生素组肉鸡出栏体重最高，耗料增重比最低。

表2 苯甲酸和精油组合对肉鸡生长性能的影响

2.2 苯甲酸和精油组合对肉鸡屠宰性能及免疫器官发育的影响如表3所示，苯甲酸+精油对肉鸡胸肌率、腿肌率及肌胃、腺胃相对重、免疫器官指数的影响均不显著。

表3 苯甲酸和精油组合对肉鸡屠宰性能和免疫器官指数的影响

2.3 苯甲酸和精油组合对肠道微生物的影响

2.3.1 苯甲酸和精油组合对肉鸡回肠微生物区系的影响如图1所示，3组所共有的OTUs为328个。其中，对照组和抗生素组共有208个OTUs，对照组和苯甲酸+精油组共有139个OTUs，抗生素组和苯甲酸+精油组共有51个OTUs。如图2所示，Specaccum物种累积曲线已到达平台期，说明实际测序量足以覆盖群落物种组成，能够真实反映群落各物种间的相对比例关系，并间接反映样品中物种的丰富度。

图2 Specaccum物种累积曲线

2.3.2 苯甲酸和精油组合对肉鸡肠道微生物-多样性的影响如表4和图3所示，苯甲酸+精油组多样性的Chao1和Observed_species指数均低于对照组（<0.05），且有降低Shanon指数的趋势（>0.05）。

图3 苯甲酸和精油组合对肉鸡肠道微生物α-多样性的影响

表4 苯甲酸和精油组合对肉鸡肠道微生物α-多样性的影响

2.3.3 苯甲酸和精油组合对肉鸡肠道微生物-多样性的影响非量度多维尺度分析（Non-metric Multidimensional Scale，NMDS）结果的应力值（Stress）越小越好，一般认为当该值小于0.2时，NMDS分析的结果较可靠。如图4、图5所示，不同处理的肉鸡菌群结构出现了一定差异，NMDS的应力值为0.18，表明NMDS分析结果可信。

图4 微生物NMDS分析图

图5 微生物主坐标分析（PCA）图

2.3.4 苯甲酸和精油组合对肉鸡回肠不同分类水平菌群的影响由表5和图6可见，门水平上，肉鸡肠道微生物中相对丰度最高的4个门类分别为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门以及拟杆菌门。其中3个组间门水平上的菌群丰度无显著差异。苯甲酸+精油组厚壁菌门丰度高于抗生素组（>0.05）。抗生素组变形菌门丰度最高（8.71%），苯甲酸+精油组最低（0.81%）。

表5 苯甲酸和精油组合对肉鸡肠道菌群门水平相对丰度的影响 %

图6 微生物门水平相对丰度

由表6和图7可见，属水平上，对照组肉鸡肠道中不动杆菌的相对丰度高于抗生素组和苯甲酸+精油组（=0.05）。与抗生素组相比，苯甲酸+精油组能降低肠杆菌属丰度（<0.05），乳杆菌属丰度提高33.5%（>0.05）。

图7 肠道微生物属水平相对丰度

表6 苯甲酸和精油组合对肉鸡肠道微生物属水平相对丰度的影响 %

3 讨论

3.1 苯甲酸和精油组合对肉仔鸡生长性能的影响苯甲酸有提高肉鸡增重的趋势，但过量添加会抑制肉鸡生长。苟清碧等研究表明，日粮中添加包埋苯甲酸可提高青麻脚鸡体重，且可降低耗料增重比。Hernández 等研究表明，百里香酚精油混合物对14～21日龄肉仔鸡的日增重有改善作用。朱晓磊等研究表明，添加不同水平的百里香酚可以提高麻花肉鸡的体重。由此可见，单独添加适量的苯甲酸或植物精油对肉鸡生长有改善作用。而植物精油和有机酸混合对肉鸡生长的作用也有相关报道。张杏莉研究发现，不同水平（150、200、250 mg/kg）的“精油+有机酸”包被制剂均可提高肉鸡平均日增重，降低耗料增重比，改善肉鸡生长性能。Aristimunha等研究表明，使用苯甲酸和精油混合物能改善1～42日龄肉鸡生长和饲料转化率。Gao等报道，精油和苯甲酸混合物能改善0～21 日龄日增重和耗料增重比。Yang等和Pham等均报道，使用酸化剂和精油混合物能改善肉鸡耗料增重比。这些有益效果可能是有机酸通过降低饲粮pH，促进肠道消化，而精油能增加胆盐分泌，提高肠黏膜和胰腺的酶活性，进而影响肉鸡生长。但也有研究发现，肉鸡日粮中添加有机酸和植物提取物对生长性能的影响不显著。同样，本试验所用精油由百里香酚、丁香酚、胡椒碱等组成，与苯甲酸同时使用，对提高增重有一定效果，但未达到统计学显著水平。各研究结果不尽一致，可能与所用产品工艺及添加水平、饲养管理及所用试验动物有关。本试验中，试验动物的饲养密度较小，整个过程中鸡群较为健康，成活率较高，使用抗生素以及苯甲酸和精油组合均未有显著的促生长效果。

3.2 苯甲酸和精油组合对肉鸡屠宰性能及免疫器官发育的影响本试验结果发现，苯甲酸和精油组合对胸肌率、腿肌率以及肌胃、腺胃发育无显著影响。Isabel等研究表明，日粮中添加酸化剂和精油以及二者混合对肉鸡胴体出成率的影响不显著，但使用精油对胸肌率有一定影响。Leeson等报道，联合使用维吉尼亚霉素和丁酸对肉鸡胴体出成率无显著影响。García等研究也发现，甲酸和植物精油对肉鸡胴体出成率、胸肌和腿肌率均无显著影响。以上结果均表明，酸化剂和植物精油对鸡屠宰性能无显著影响。

本试验未发现苯甲酸和精油对肉鸡免疫器官发育有显著影响。胡骁飞等发现，在 1～42日龄爱维茵肉仔鸡基础日粮中添加牛至油可刺激免疫器官发育，增加免疫器官重量，机体免疫能增强。熊娟等研究发现，使用精油能显著刺激法氏囊发育，对脾脏的影响不大。朱晓磊等研究报道，添加百里香精油能显著提高麻花鸡胸腺指数和法氏囊指数。本试验与以上研究结果不尽一致，可能是所用酸化剂和精油组合产品种类及剂量并不足以刺激免疫器官改变。

3.3 苯甲酸和精油组合对肉鸡肠道微生物的影响肠道菌群组成对宿主机体的健康、新陈代谢、营养物质消化吸收和免疫有重要影响。-多样性反映了单个样品物种丰度及物种多样性，可通过Chao1指数、Observed_species指数、Shannon指数和Simpson指数常用来反映菌群的-多样性，前3个指数越大，说明菌群的多样性和丰富度越高；Simpson指数越大表明优势菌群占总体生物菌群比重越大。杨建平等研究表明，蛋鸡饲粮中添加复合植物精油对盲肠菌群的 Chao1指数无显著影响，但能显著降低Shannon指数，说明饲粮中添加八角茴香和百里香复合精油减少盲肠菌群的多样性。Gunal等研究表明，有机酸不影响肉鸡生产性能，但会降低肠道微生物数量。本试验结果表明，使用苯甲酸和精油组合会降低菌群的丰度，可能与组合方案中所用的精油及苯甲酸抑制有害菌的增殖有关。

本试验结果显示，肉鸡回肠菌群在门水平上的优势菌群为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门。厚壁菌门能促进日粮中能量的利用，厚壁菌的增加与营养吸收的增加有关，有助于提高生产性能。本试验发现，苯甲酸和精油组合组肉鸡厚壁菌门高于对照组和抗生素组，这与Pham等的研究一致。变形菌门是动物肠道微生物中另一大门类，变形菌门含有许多病原体细菌，如立克次氏体属（）、布鲁氏菌属（）和奈瑟菌属（），有可能对畜禽健康产生不利影响。本试验结果表明，苯甲酸和精油组合降低了回肠变形菌门的丰度，有利于肠道健康。放线菌门在肠道中的数量较少，但此门下的双歧杆菌属却是鸡肠道内的有益菌，它能够酸化肠道内环境，抑制病原菌的生长，对动物肠道健康起着重要作用。整体上，苯甲酸和精油组合增加了厚壁菌门的相对丰度，降低了拟杆菌门的相对丰度，有利于维护肠道健康。较高的厚壁菌门数量可能会增强饲喂酸化剂和精油组肉鸡的能量吸收，从而有利于肉鸡体重的增加。

属水平的优势菌群为乳杆菌属、分节丝状菌、不动杆菌属、肠杆菌属以及葡萄球菌属，其中分解丝状菌、不动杆菌、肠杆菌及葡萄球菌属的水平均处于较低水平。不动杆菌是条件致病菌，包含一些醋酸钙不动杆菌、鲁菲不动杆菌、鲍曼不动杆菌等，当机体抵抗力降低时，容易引起动物机体的感染。Yousaf 等研究表明，添加0.20%包被苯甲酸可以调节肉鸡盲肠微生物菌群，增强乳酸杆菌的繁殖。宋凡春也发现，添加0.25%和0.50%包被苯甲酸显著提高了肉鸡盲肠乳酸杆菌的丰度。Jamroz等研究发现，在鸡饲粮中添加适宜水平的百里香酚和肉桂醛等提高了肠道乳酸杆菌的数量，降低了大肠杆菌数量。刘仲昊等研究表明，联合使用20 g/t百里香酚-香芹酚混合物能改善断奶仔猪结肠微生物群落结构，提高有益菌的相对丰度，降低有害菌的相对丰度，促进微生物的代谢功能。Giannenas等研究证实，苯甲酸和精油同时使用促进了火鸡盲肠乳酸杆菌的繁殖，减少了大肠杆菌的数量。Gao等研究也表明，苯甲酸和精油混合物减少了肉鸡盲肠大肠杆菌和沙门氏菌的数量，提高了乳酸杆菌的数量。Yang等研究发现，酸化剂和精油混合物提高了回肠食糜中乳酸杆菌丰度。本试验中属水平的物种相对丰度结果显示，抗生素组和苯甲酸+精油组均显著降低了不动杆菌的丰度，苯甲酸和精油组合还在一定程度上提高了乳酸杆菌的丰度。由此可见，苯甲酸和精油组合的优势菌群为有益菌，肠道处于较为健康的状态。这种优势菌群的维持，可能因为益生菌的适宜pH低于有害菌，而苯甲酸能维持较低的胃肠道pH，进而改善微生态平衡；苯甲酸与百里香酚-香芹酚等精油成分的选择性抗菌特性协同，可以通过促进潜在有益肠道微生物的生长和抑制有害细菌的增殖来改善肠道健康，并通过促进微生物的代谢来提高肉鸡增重，具体作用机理还需做进一步的微生物代谢功能分析。