Perilipin在牛脂肪细胞分化过程中的表达模式

雷召雄，户春丽，潘翠丽，魏大为，杨梦丽，高晓茜，王兴平，马 云*

（1.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021；2.宁夏回族自治区反刍动物分子细胞育种重点实验室，宁夏银川 750021）

脂肪沉积是一个复杂的过程，受多种激素、酶、转 录因子和多种信号通路的调控，脂肪生成主要经历增生和肥大2个过程。脂滴是脂肪细胞最主要的组成部分，由甘油三酯和少量的胆固醇构成中心脂滴的核心，外面覆盖着单层磷脂。脂滴的聚集是脂肪生成的基础，众所周知，脂肪生成分为脂肪细胞数量的增加和体积的增大。研究表明，除了能量储存，脂滴在控制细胞应激、蛋白质处理及其他生理过程中也发挥了重要的作用。Perilipin蛋白家族是脂滴表面含量最多的一种可磷酸化蛋白，能与脂滴特异性结合，其家族成员在脂滴的生成和降解过程中发挥了双向调控作用。因此，探究Perilipin蛋白家族成员的理化性质以及各蛋白之间的互作关系和其在牛脂肪细胞分化过程中的表达模式可为解析牛脂肪生成的分子机理提供理论依据，并能为未来牛遗传育种提供参考信息。

研究报道，启动子区域存在RXR的结合位点，过表达促进鸡前体脂肪细胞脂质的积累。在猪脂肪细胞分化过程中表达量逐渐增加，因此被确定为脂肪细胞分化过程中的新的候选基因。是白色脂肪细胞成熟过程中的关键调节基因，影响脂肪细胞的脂肪沉积过程。在肥胖小鼠脂肪组织中，的缺失造成了脂肪组织的褐变，并表明了脂肪褐变的机制可能有助于对肥胖的抵抗。有研究报道，在牛脂肪细胞分化的第2天，的mRNA表达量达到峰值，同时证明了和在牛脂肪生成过程中有相互作用。敲除小鼠腹股沟白色脂肪细胞中的米色脂肪细胞和产热基因的量增加，并诱导的激活，表明作为内在的保护因子，可通过阻碍脂质代谢和热基因表达来抑制米色脂肪细胞的形成。研究显示，在脂肪肉瘤中的表达显著高于非脂肪肉瘤，在含有多态性的肥胖个体中，肥胖治疗的结果会减弱。在肌内脂肪中，磷酸化会释放从而激活ATGL的表达，同时有研究观察到，在肥胖小鼠脂肪组织中的失活会下调的表达并且减少小鼠体内脂肪的蓄积。综上，Perilipin蛋白在脂肪生成和降解过程中起了非常重要的作用。

因此，本研究拟采用实验验证和生物信息学分析的方式对Perilipin蛋白的理化性质进行分析，并探究其在牛脂肪细胞分化前后的表达模式，以期为进一步解释在牛脂肪生成过程中的分子机制提供前期的参考数据并为未来牛遗传育种提供参考信息。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞样采集 本实验中用于分离培养牛前体脂肪细胞的当日早产犊牛由泽瑞生态养殖牧场赠予。犊牛带回实验室全身消毒后颈部放血，快速打开腹腔采集牛肾周脂肪组织，先用含5%双抗的PBS冲洗1次再用含2%双抗的PBS清洗2次，转移到含有1%双抗的PBS中并快速地转移到细胞间。

1.1.2 主要试剂 Trizol试剂、反转录试剂盒、2×SYBRPremix Ex Taq（2×）由TaKaRa公司（日本）提供；I型胶原酶、油红O由北京索莱宝科技有限公司提供；无水乙醇、氯仿、异丙醇、甲醛等均为国产分析纯。DMEM高糖培养基、青链霉素混合液、胰酶、PBS购自海克隆生物化学制品（北京）有限公司；胎牛血清购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；罗格列酮、地塞米松和IBMX均购自Singma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Perilipin进化树构建 为了探究Perilipin蛋白在不同物种之间的进化关系，在NCBI数据库下载Perilipin家族各蛋白的氨基酸序列，并利用MEGA5.0结合Fig tree分析了Perilipin氨基酸序列在牛（）、水牛（）、山羊（）、猪（）、鸡（）以及人（）和小鼠（）之间的进化关系。

1.2.2 牛Perilipin的染色体定位及与水牛Perilipin的染色体共线性分析 为了探究牛基因在染色体上的定位和水牛之间的共线性关系，从基因组序列和注释文件中提取预测的牛和水牛基因的位置信息，利用TBtools对牛Perilipin在染色体上的位置进行定位和可视化分析，用2个物种已鉴定的Perilipin在染色体上进行作图，并采用MCScanx包结合TBtools对牛和水牛的基因进行共线性分析。

1.2.3 牛Perilipin蛋白的结构域、亲疏水性分析及蛋白互作网络预测 为了确定牛Perilipin家族蛋白的结构域、亲疏水性质以及互作蛋白预测，首先从NCBI数据库中下载了牛Perilipin的不同转录本，利用上述转录本数据在在线软件NCBI-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）和TBtools中分析了Perilipin蛋白的结构域，利用TBtools进行可视化；并利用在线软件ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）分析了Perilipin蛋白的亲疏水性；最后利用在线软件String（https://www.string-db.org/cgi/input?sessionId=bg1PKUZkNR9S&inp ut_page_show_search=on）对Perilipin家族5个蛋白进行互作网络预测。

1.2.4 牛前体脂肪细胞的分离培养及诱导分化 本实验采用I型胶原酶消化法分离培养牛前体脂肪细胞，方法见文献。简单来说，选取2块大约1 cm的肾周脂肪组织，用剪刀剪成大约1 mm的小块，转移到15 mL离心管中，加入3 mL I型胶原酶（2 mg/mL）在37℃水浴锅中消化90 min，期间，每10 min转动离心管1次。待消化法得到的细胞融合度达到100%时，将培养基更换为诱导分化培养基（含10 μg/mL胰岛素、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX和1 μmol/L罗格列酮的完全培养基），诱导2 d后，弃去诱导分化培养基，加维持分化培养基（含10 μg/mL胰岛素和1 μmol/L罗格列酮的完全培养基），每2 d换液1次并收集一批细胞。诱导10 d后，收获最后一批细胞，用于qPCR分析。

1.2.5 油红O染色及细胞内甘油三酯含量的测定 利用油红O对分化前和分化完成后的牛前体脂肪细胞染色进行形态学观察，用PBS将油红O储存液（油红O+PBS）按照2:3稀释成工作液，用10%的福尔马林固定细胞后染色，最后用异丙醇收集油红O，用全波长多功能酶标仪测定480 nm处的OD值。

1.2.6 细胞总RNA的提取和cDNA的获得 采用酚氯仿法提取细胞总RNA，操作流程参照Trizol试剂盒说明书，利用多功能全波长酶标仪检测总RNA的浓度（ng/µL）及OD值（OD/OD的比值在1.8～2.0符合要求），利用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性（能清晰地看到28S和18S的条带即认为总RNA质量符合标准）。并根据反转录试剂盒说明书中提供的随机引物将获得的总RNA1 000 ng反转录成cDNA保存于-20℃冰箱，备用。

1.2.7 Perilipin时序表达谱检测 采用Primer Premier 5.0设计定量引物（表1）；利用qPCR技术检测牛前体脂肪细胞分化0、2、4、6、10 d过程中Perilipin的相对表达水平，以细胞cDNA为模板进行实时荧光定量PCR（n=3），qPCR反应体系：SYBR Green 7.5 µL，cDNA 4 µL（cDNA原液稀释5倍），上下游引物（10 μmol/L）各0.3 µL，RNase-free ddHO 2.9 µL。qPCR反应程序：预变性3 min（95℃），变性10 s（95℃），退火20 s（59～61℃），延伸30 s（72℃），设置40个循环，内参基因选用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。

表1 引物信息

1.2.8 数据分析 2法分析荧光定量的结果，数据以“平均值±标准误”表示。用GraphPad Prism 8软件进行单因素方差（One-Way ANOVA）分析，其中<0.01为差异极显著，<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 Perilipin蛋白在不同物种之间的进化树构建 系统进化树结果显示，牛的Perilipin蛋白中，PLIN1、PLIN2、PLIN3、PLIN5氨基酸序列与水牛相似度最高，其次为山羊；水牛和山羊的PLIN4氨基酸序列同源性最高，其次与牛聚为一支，如图1，提示牛的Perilipin蛋白与水牛和山羊的相似度最高。

图1 Perilipin蛋白在牛和其他物种之间的进化关系

2.2 Perilipin的染色体定位和共线性分析 共线性分析结果显示，基因分布在牛的BT7（、、）、BT8（）和BT21（）染色体上，分布在水牛的BB3（）、BB9（、、）和BB20（）染色体上（图2A），其中、、是位于牛和水牛同一条染色体上的3个串联基因。共线性分析结果表明，牛（2n=60）和水牛（2n=50）的染色体数目不同，但2个物种的染色体之间存在广泛的同源关系。在基因中，位于牛7号染色体的和、8号染色体的、21号染色体的分别与位于水牛9号染色体的和、3号染色体的和20号染色体的存在共线性关系，但未找到在牛和水牛上的共线性信息（图2B）。

图2 Perilipin的染色体定位和共线性分析

2.3 Perilipin蛋白结构域分析 Perilipin蛋白结构域分析结果显示，该家族成员均含有Prelipin结构域，其中，PLIN1、PLIN2，PLIN3、PLIN5只 含 有1个Perilipin结构域，并且该结构域约位于0～300位氨基酸之间；PLIN4含有15个Perilipin结构域，如图3。

图3 Perilipin蛋白结构域分析

2.4 Perilipin亲疏水性分析 亲疏水性分析结果表明，PLIN1在146位aa处有最大值2.133，294～296 aa之间有最小值为-3.122（图4A）；PLIN2在65位aa处有最大值1.944，在426位aa处有最小值-2.844（图4B）；PLIN3在267位aa处有最小值为-2.822，422位aa处有最大值1.789（图4C）；PLIN4在12位aa处有最小值-2.656，在1 653位aa处有最大值为1.700（图4D）；PLIN5在276位aa处有最小值-3.156，367位aa处有最大值2.089（图4E）。总体上Perilipin蛋白均呈疏水性。

图4 Perilipin蛋白亲疏水性分析

2.5 牛Perilipin蛋白互作网络预测 预测Perilipin蛋白家族成员之间的互作关系，结果表明，PLIN4与PLIN5和PLIN1之间直接发生互作，并通过其他中间基因最终直接或间接作用于脂肪标志基因LPL和FABP4；此外，PLIN2和PLIN3也可以通过LIPE、PNPLA2和ABHD5间接作用于脂肪生成相关基因，如图5所示。

图5 牛Perilipin蛋白互作网络预测

2.5 牛脂肪细胞油红O染色及OD值检测 对分化前后的脂肪细胞进行油红O染色，结果显示，分化完成后的脂肪细胞中脂滴聚集明显多于分化前的细胞（图6A），油红O提取后检测480 nm处的吸光度值，结果显示，分化后的细胞中脂滴含量明显高于分化前的细胞，两组间差异显著（图6B），对细胞总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果能清晰看到28S、18S和5S 3条带（图6C）。

图6 牛脂肪细胞油红O染色（100×）、OD值检测和细胞总RNA电泳

2.6 牛Perilipin时序表达谱构建 qPCR检测在牛前体脂肪细胞分化过程中的表达模式，如图7所示。结果显示，随着脂肪细胞分化进程逐渐上升，在脂肪细胞分化的终末阶段表达量达到峰值（图7A）；在脂肪细胞分化的第2天达到最大，此后逐渐下降（图7B）；随着脂肪细胞的分化逐渐降低，在分化的第6天达到最小值，并且差异显著（图7C）；随着脂肪细胞分化其表达量逐渐升高，在分化的第10天达到峰值（图7D）总体趋势与一致；呈上升的表达趋势，并且在分化完成时其表达量达到最大（图7E）。

图7 牛Perilipin时序表达谱构建

3 讨 论

脂肪组织不仅在能量平衡的调节中起着关键作用，还是重要的内分泌器官，脂肪组织主要分为白色脂肪组织（White Adipose Tissue,WAT）和棕色脂肪组织2种类型。WAT占体内脂肪组织的绝大部分，主要以甘油三酯的形式储存能量，并以游离脂肪酸的形式释放能量。Perilipin定位在脂滴表面，对脂肪的生成和分解起重要作用。因此，本研究对Perilipin进行生物信息学分析，并以犊牛肾周脂肪为实验材料，诱导分化后检测Perilipin在牛脂肪细胞生成过程中的表达模式，以期为后续进一步探究Perilipin在牛脂肪生成过程中的分子机制提供参考数据。

本实验对Perilipin进行生物信息学分析发现，牛Perilipin蛋白与水牛和山羊之间的相似度最高，基因中，、、和定位在牛与水牛不同的染色体上，但是未发现在黄牛和水牛基因组上的共线性关系，后续将继续探究其原因，牛的Perilipin蛋白均含有Perilipin结构域，研究显示，Perilipin蛋白家族都参与了脂滴的形成，并且在不同条件下在脂滴功能中发挥了作用。对牛Perilipin蛋白的亲疏水性进行分析，结果表明，Perilipin蛋白均呈现疏水性，有研究报道，Perilipin蛋白是脂滴相关蛋白，在哺乳动物中主要表达在脂肪及脂肪相关组织中。多数细胞有微小脂滴，表面有和，具有较大脂滴的专门贮脂细胞也表达了、和（或），、和通过控制脂肪酶和脂肪酶辅助因子进入脂滴中的底物脂类途径来调节脂解。此外，研究表明、和在脂滴形成过程中具有协同作用。对分化前后的脂肪细胞进行油红O染色发现，分化完成后的细胞中脂滴含量显著高于分化前的细胞；qPCR结果显示，、和随着脂肪细胞的分化其表达量逐渐上升，并且在分化的终末阶段达到峰值，本实验室先前的相关研究显示，在牛脂肪细胞分化过程中依赖于的表达而表达，在基因启动子区存在功能性的的特异性应答元件。Li等研究表示的表达量在脂肪细胞分化的第6天达到最高，其核心启动子区位于基因的-209/-17 bp区域，此外，还鉴定了和的结合位点是核心启动子区域的转录激活子或抑制因子。缺乏时脂肪质量降低并且促进脂肪组织的炎症反应和脂解。在牛的研究中，过表达上调了及其靶基因和D的表达，抑制和的表达，从而增强脂肪酸和TAG的合成，抑制脂解。此外，PLIN4是否变异也跟体内脂肪水平密切相关。PLIN4在细胞或体外生成的油滴表面形成了一层稳定的蛋白质层，并减小了脂滴大小，其通过极性/静电相互作用形成了相邻两亲性螺旋的稳定排列。研究空腹PLIN5的水平和细胞内脂滴含量的关系时发现，大量的PLIN5提高了细胞储存脂滴的能力。结合以上研究结果，PLIN1、PLIN4和PLIN5在脂肪细胞分化聚酯过程中起到了显著的正调控作用；在脂肪细胞分化的第2天其表达量达到最大，随后逐渐降低，与此结论一致的是，Li等研究报道，在秦川牛脂肪细胞分化的第2天表达量达到最大，并且与相互作用调控牛脂肪细胞的分化。随着牛脂肪细胞的分化其表达量逐渐降低，在第6天时达到最小，有研究报道了主要靶向新生成的脂滴，并且在不与脂滴结合时在细胞质中保持稳定，由此推测，主要在脂滴开始形成时起作用，之后其作用逐渐减弱。此外，对Perilipin各蛋白进行互作网络预测的结果也表明，直接作用于和并最终作用于脂肪生成的标志基因，而PLIN3和PLIN2主要作用于PNPLA2和ABHD5等蛋白，研究显示，PNPLA2和ABHD5能发生强烈的互作效应，在棕色脂肪组织中，过表达能抑制PNPLA2/ATGL依赖性脂解并促进甘油三酯的积累。根据以上分析及实验结果，推测Perilipin蛋白家族成员在脂肪细胞分化的不同阶段起作用，并且各蛋白成员之间的互作共同维持了脂肪细胞中脂滴的正常生成和降解。

4 结 论

综上所述，本研究通过实验验证结合生物信息学分析的方法，阐明了Perilipin蛋白家族成员在牛脂肪细胞表面的理化性质和各蛋白之间的互作关系，并揭示了其在脂肪细胞分化过程中的表达模式，据此说明在牛脂滴聚集的不同阶段均发挥了作用，并且在牛脂肪生成的过程中具有双向调控作用，目前为止，尚未有研究报道PLIN4和PLIN1、PLIN5之间作用的分子机制。基于此，探究Perilipin之间如何协调调控牛脂肪细胞中的聚脂过程将成为后续研究重点，也将成为进一步挖掘Perilipin的分子机制并提高牛遗传育种的关键一步。