SLC12A9、GNG2基因在正常与啄羽番鸭不同组织中的表达差异分析

王 姣，罗林丽，张 芸，祝永才，杨娇一，廖富友，姚炳浓，杨胜林*

（1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；2.高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025；3.贵州省农业区域经济发展中心，贵州贵阳 550025）

番鸭体型硕大，身躯长、略扁，前后窄、中间宽，呈纺锤形；具有生长快、耐粗饲、易育肥、瘦肉率高、肉质鲜美等特点，是优质肉鸭品种。家禽的啄羽（FP，Feather Pecking）行为对羽毛的损失、皮肤伤害和死亡负有责任，因此，FP既是一个主要的福利问题，也是经济损失的原因。FP行为在学术界有3种理解：一种理解为重定向采食行为，受中枢神经递质5-羟色胺（5-HT）和多巴胺（DA）的调控；另一种理解为适应不良行为，与动物生存环境相关；还有一种理解为病理学行为，与环境无关，主要受遗传因素的影响。有研究表明，啄食羽毛的潜在动机是吃羽毛，或者这是一般多动症的结果。Lutz等人应用GWAS技术发现基因和可能与啄羽和攻击行为有关。

溶质载体家族12成员9（Solute Carrier Family 12 Member 9，）基因属于编码电子中性阳离子-氯离子转运蛋白的9个基因家族之一。虽然该基因的功能尚不清楚，但已知其他SLC12转运蛋白在控制电化学氯离子梯度方面至关重要，且家庭成员之间的氨基酸相似性在19%～76%之间。基因家族一些成员的缺乏通常会让小鼠患上巴特氏综合征、吉特曼综合征、胼胝体、周围神经病、癫痫等疾病。G蛋白Y2亚基（G protein Subunit Gamma 2，）属于c亚单位的亚家族II。被确定为一种特定的大鼠幽闭标志，尽管幽闭状态的功能意义目前未知，但它的位置和神经联系表明，它可能在整合构成意识感知基础的信息中发挥作用。

本研究拟通过对、基因在番鸭不同组织的差异表达分析，以及对具有啄羽行为的番鸭大脑组织进行、基因实时荧光定量，比较2个基因的表达差异，探究、基因与番鸭啄羽行为是否相关。

1 材料与方法

1.1 实验动物与样品采集 实验选取正常与啄羽6月龄的番鸭共27只，置于贵州大学养殖场内进行行为学观察。实验动物均匀分为9组，每组3个重复。鸭笼为1.5 m×1.5 m×0.7 m（饲养方式为平养，以排除空间等因素对番鸭行为的影响）。饲喂期间，日粮营养充沛，自由采食、饮水，按期清扫鸭舍内的卫生，按期清理粪便、消毒，保证鸭舍内饲养环境优良。挑选无FP行为的番鸭3组，采集心、肝、脾、肺、肾、胰、肌胃、腺胃、视丘、大脑和小脑的组织样品共11个，再挑选出具有FP行为与无FP行为的番鸭各3组采集大脑组织，放进冻存管中并贮存于-80℃。

1.2 主要仪器 紫外可见分光光度计、电泳仪（DYY-2C型）、PCR扩增仪（C1000Touch）、实时荧光定量PCR仪（型号为CFX96 Real-Time System）、凝胶成像系统（Universal Hool ll）、-80℃冰箱、-20℃冰箱、4℃冰箱、超净工作台。

1.3 主要试剂 RNA提取剂Trizol、液氮（-196℃）、三氯甲烷、0.5×TAE缓冲液、异丙醇、75%乙醇、琼脂糖；荧光定量试剂2×Ts Master qRT-PCR Mix购自擎科生物科技有限公司；cDNA第1链合成逆转录试剂盒采用HiFiScript cDNA Synthesis Kit（康为世纪）。

1.4 实验方法

1.4.1 组织样总RNA提取及cDNA合成 实验采用Trizol法进行心、肝、脾、肺、肾、胰、肌胃、腺胃、视丘、大脑和小脑组织样总RNA提取，微量紫外分光光度计测定浓度及OD值（每个样品3次重复）。将啄羽番鸭与正常番鸭不同组织RNA浓度分别定量至500 ng/μL，然后根据康为世纪试剂盒说明书步骤进行逆转录得到cDNA第1链。转录步骤为：①将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、5×RT Buffer、HiFiScript和RNase-Free water溶解，并置于冰上；②配制反应体系，总体积30 μL：dNTP Mix 4 μL，Primer Mix 2 μL，RNA模板2 μL，RNase-Free water 30 μL；③70℃孵育10 min，迅速冰浴2 min；④短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底；⑤继续向以上反应体系中加入试剂：5×RT Buffer 4 μL，DTT 2 μL，HiFiScript 1 μL；⑥42℃孵育40 min，85℃孵育5 min；⑦反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。转录完成后，取1 μL反应产物于超微量紫外分光光度计进行浓度和纯度检测，-20℃保存，备用。

1.4.2 引物设计与扩增条件优化 参照NCBI数据库中的鸭、基因的mRNA序列，用Primer Premier 5.0软件设计、基因的荧光定量引物。荧光定量内参基因为，送上海生工生物工程股份有限公司合成，内参、引物信息见表1。

表1 SLC12A9、GNG2基因荧光引物序列、退火温度及目的片段大小

1.4.3 实时荧光定量PCR 采取SYBR GreenⅠ嵌合荧光法对、基因在正常番鸭11个组织样中的表达进行实时荧光相对定量分析。荧光染料购自北京康为试剂生物科技有限公司。荧光定量PCR仪采用的系统为BIO-RAD CFX massage，反应体系为：2×Ultra SYBR Mixture 5 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各0.5 μL，cDNA 1 ng/μL，ddHO补足10 μL。扩增程序：95℃预变性30 s；95℃变性10 s，61℃（）/62℃（）退火30 s，68℃延伸30 s，40个循环；95℃变性5 s；最后由机器自动设置（基础温度60℃，每5 s增加0.5℃扩增至95℃）进行熔解曲线收集。

1.4.4 荧光定量PCR数据分析与统计 运用2法算出、基因在各组织的表达量。计算公式：∆Ct=基因的cq值-对应样品内参的cq值，∆∆Ct=∆Ct值-第1个∆Ct值，2=2^-∆∆Ct值，AVERAGE为2值通过平均值函数求得，STDEVP为根据2值通过标准差函数求得；数据的差异显著性利用SPASS软件比较，最后利用GraphPad Prism v8.0.2.263软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取检测 从健康番鸭的11个组织中提取总RNA，经微量紫外分光光度计测定，各样品总RNA的OD/OD都 在1.80～2.01之 间，OD/OD的值均在2.0以上，且各组织样最大吸收峰值均在260 nm处，说明提取的组织样总RNA纯度良好，无蛋白质及其他杂质污染，符合进行荧光定量PCR的要求。

2.2 普通PCR检测、基因 利用上述1.4设计的、基因以及鸭内参基因荧光定量PCR扩增引物，分别对逆转录的cDNA进行普通PCR扩增，扩增的产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，验证获得目的条带的正确性。电泳结果见图1、图2。结果表示：扩增的目的产物条带透明、引物二聚体极弱、特异性好，长度分别为139 bp、122 bp，与预估目的片段大致相同，可进行下一步荧光定量表达分析实验。

图1 SLC12A9基因的PCR扩增图片

图2 GNG2基因的PCR扩增图片

2.3 荧光定量PCR检测、基因在番鸭各组织的表达差异分析 由图3可知，基因在番鸭心、肝、脾、肺、肾、胰、肌胃、腺胃、视丘、大脑和小脑11个组织中均有表达，表达量依次为：心>胰>肝>视丘>小脑>腺胃>脾>肾>肺>大脑>肌胃，具有最高表达量的组织为心脏，极显著高于其他组织，在肌胃中的mRNA表达量最低（<0.01）。

图3 SLC12A9基因在番鸭各组织间的表达情况

由图4可知，基因在正常番鸭的肌胃、心脏、肺脏、肾脏、肝脏、腺胃、胰脏、大脑、小脑、视丘、脾11个组织样中均有表达，小脑与视丘中的mRNA表达量极显著高于大脑、心、肝、脾、肺、肾、肌胃、腺胃、胰组织，且小脑与视丘之间差异不显著；基因在番鸭各组织中的mRNA表达量依次为：小脑>视丘>大脑>胰>脾>肺>心>肝>腺胃>肾>肌胃；基因在小脑与视丘的mRNA表达量极显著高于大脑，且小脑、视丘与大脑均极显著高于另外8个组织，在肌胃组织的mRNA表达量最低（<0.01）。

图4 GNG2基因在番鸭各组织间的表达情况

2.4、基因在啄羽番鸭与正常番鸭大脑组织的表达差异分析 由图5可知，基因在FP番鸭群体与正常番鸭群体的大脑组织中均有表达，正常3组番鸭的mRNA表达量最高，极显著高于其他5组，且基因在啄羽1、啄羽2、啄羽3及正常2组番鸭大脑组织的mRNA表达量显著高于正常1组；基因在不同组的mRNA表达量依次为正常3>啄羽3>正常2>啄羽2>啄羽1>正常1。

图5 SLC12A9基因在啄羽番鸭与正常番鸭大脑组织的表达情况

由图6可知，基因在啄羽番鸭与正常番鸭的大脑组织中均有表达，且基因在啄羽3组的mRNA表达量极显著高于其余5组；并且这5组之间基因在大脑组织的mRNA表达量不存在显著差异；各组的mRNA表达量依次为：啄羽3>正常1>正常3>啄羽1>啄羽2>正常2。

图6 GNG2基因在啄羽番鸭与正常番鸭大脑组织的表达情况

3 讨 论

3.1基因在番鸭不同组织的表达情况及对啄羽行为的影响 本实验通过实时荧光定量测定基因在正常番鸭各组织的表达情况，结果表明基因在正常番鸭的心脏组织具有最高表达量，与Hebert等人在人类疾病研究中得到基因家族主要位于心脏、肾脏的结果相似。本实验将通过观察具有啄羽行为的番鸭与正常番鸭的大脑组织进行实时荧光定量，分析基因在啄羽番鸭与正常番鸭的表达量差异，发现基因在啄羽番鸭与正常番鸭的大脑组织表达量具有显著差异，与Lutz等人应用GWAS技术在高度啄羽鸡和低度啄羽鸡的大脑中发现基因可能与啄羽和攻击行为有关的结果相似。另外，Gagnon等人通过建立小鼠模型探究基因家族对人类疾病的影响中发现，基因家族的缺乏会引起小鼠的神经元兴奋、手足癫痫等疾病，与本实验结果相似。本实验中基因在正常番鸭个体出现最高表达量，表明基因与番鸭啄羽行为可能呈反比关系，Van等人研究表示基因家族可能具有神经元保护作用。但本实验中其他正常番鸭个体的大脑基因表达量没有显著高于啄羽番鸭，可能是样本的选择误差，也可能是在处于啄羽的潜伏期，还没有表现出啄羽行为。其中原因需要进一步探究。

3.2基因在番鸭不同组织的表达情况及对啄羽行为的影响 通过实时荧光定量测定基因在正常番鸭各组织的表达情况，结果发现基因几乎在正常番鸭的脑组织进行表达，其中在小脑的表达量最高。分析基因在啄羽番鸭与正常番鸭的表达量差异，发现基因在啄羽番鸭与正常番鸭的大脑组织表达量具有显著差异，与Lutz等人应用GWAS技术检测的8个基因在高度啄羽行为鸡和低度啄羽行为鸡大脑中的不同表达结果相似，证明候选基因可能与啄羽和攻击行为有关。秦洪猛等人研究表示基因的沉默会改善大鼠的认知功能，认知损害通常被认为是神经变性疾病的表现。在早些年的一项研究中，GNG2蛋白已被确定为大鼠体内的一种特异性幽闭标志，表明基因可能与动物精神疾病相关。与本实验基因在啄羽番鸭个体出现最高表达量、基因与番鸭啄羽行为可能呈正相关的结果相似。但本实验中其他啄羽番鸭个体的大脑基因表达量没有显著高于正常番鸭，可能是因为样本挑选的误差，也可能是啄羽1、2号番鸭的啄羽症状较轻，正处于改善时期，其中原因需进一步探究。

4 结 论

通过实时荧光定量检测，表明、基因在正常番鸭各组织均有表达，基因在心脏的表达量最高，基因则在小脑组织的表达量最高；实时荧光定量分析结果表明，、基因均在正常番鸭与啄羽番鸭大脑组织表达，且基因可能与番鸭啄羽行为呈负相关，基因可能与番鸭啄羽行为呈正相关。本研究为在分子遗传方向进一步进行家禽啄羽行为的研究提供了基础数据。