反相高效液相色谱法测定枯草菌肽的含量及纯度

杨彩霞 吴金梅 何涛

摘要 [目的]建立枯草菌肽含量及純度的反相高效液相色谱（RP-HPLC）检测方法。[方法]采用ZORBAX 300SB-C 8（4.6 mm×150 mm，5 μm），以三氟乙酸-水（1∶1 000）为流动相A，以三氟乙酸-水-乙腈（0.85∶200∶800）为流动相B;柱温25 ℃，检测波长280 nm，流速1.0 mL/min，进样量20 μL，线性梯度洗脱。[结果]在室温条件下，枯草菌肽溶液12 h内稳定，RSD为0.61%;枯草菌肽主峰保留时间和峰面积的RSD分别为0.18%和0.22%，不同实验员间的 RSD为0.92%;枯草菌肽的定量限（LOQ）为120 ng、检出限（LOD）为80 ng，在0.031 25～2.000 00 mg/mL线性关系良好（R2=1）;平均回收率为101.49%（n=9），RSD为0.29%;改变柱温、流速和色谱柱批号，枯草菌肽理论塔板数均大于2 000，分离度均大于1.5，相对保留时间（RRT）偏差绝对值均不大于20%。测定3批枯草菌肽含量分别为98.8%、99.8% 和 100.2%;纯度均大于99%。[结论]该研究建立的检测方法灵敏、准确、专属性强，符合定量检测枯草菌肽含量和纯度的要求，适用于枯草菌肽的质量控制。

关键词 枯草菌肽;反相高效液相色谱法;含量;纯度;定量检测

中图分类号 R 927.2文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）02-0206-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.02.056

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of the Content and Purity of Sublancin by Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography

YANG Cai-xia1，2，WU Jin-mei3，HE Tao1，2 （1.Sinagri Yingtai Linzhou Biotechnology Park Co.，Ltd.，Anyang，Henan 456550;2.Beijing Sinagri Yingtai Biological Technology Institute Co.，Ltd.，Beijing 100193;3.Henan University of Animal Husbandry and Economy，Zhengzhou，Henan 450046）

Abstract [Objective] To establish a reversed-phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC） method for detecting the content and purity of sublancin.[Method]Chromatography was performed on ZORBAX 300SB-C 8 chormagraphic column （4.6 mm×150 mm，5 μm），using trifluoroacetic acid-water （1∶1 000） as mobile phase A，using trifluoroacetic acid-water-acetonitrile （0.85∶200∶800）as mobile phase B;the column temperature was 25 ℃，the detection wavelength was 280 nm，the flow rate was 1.0 mL/min，the injection volume was 20 μL，linear gradient elution.[Result]At room temperature，the sublancin solution was stable within 12 hours，and the RSD was 0.61%.The RSD of the main peak retention time and peak area of subtilisin were 0.18% and 0.22%，respectively，and the RSD between different experimenters was 0.92%.The limit of quantification （LOQ） of sublancin was 120 ng，the limit of detection （LOD） was 80 ng，and the linear relationship was good between 0.031 25 and 2.000 00 mg/mL （R2=1）.The average recovery rate was 101.49% （n=9），and the RSD was 0.29%.Changed the column temperature，flow rate and chromatographic column batch number，the theoretical plate numbers of sublancin were all greater than 2 000，the degree of separation was greater than 1.5，and the absolute deviation of the relative retention time （RRT） was less than 20%.The content of three batches of sublancin were 98.8%，99.8% and 100.2%，respectively，with purity greater than 99%.[Conclusion]The detection method established in this study is sensitive，accurate and highly specific，which meets the requirements for quantitative detection of sublancin content and purity，and is suitable for quality control of sublancin.

Key words Sublancin;RP-HPLC;Content;Purity;Quantitative detection

作者简介 杨彩霞（1987—），女，河南商丘人，兽医师，硕士，从事新兽药研发与注册申报工作。

收稿日期 2021-05-26

在畜禽生产中，抗生素被广泛用作疾病的预防、治疗和促进生长[1]。但随着抗生素的大量使用甚至滥用，耐药性和药物残留问题日益严峻[2]，不仅导致生产动物的抗感染治疗难度加大，而且导致其免疫力低下，由此引起生产动物的疫病发病率高，死亡率高。因此，开发抗生素替代产品，尤其是增强生产动物免疫力的药物，用于畜牧养殖业是亟需解决的任务[3]。

枯草菌肽是由枯草芽孢杆菌产生的含有37个氨基酸的生物多肽，其理化性质极其稳定[4-5]，具有改善动物肠道健康、提高机体免疫力和生长性能的功能[1，3，6-12]，在畜牧行业上有着巨大的应用前景。目前，在国内外，中农颖泰林州生物科园有限公司是唯一一家实现枯草菌肽产业化生产的单位，为了更好地对枯草菌肽相关产品进行质量控制，通过查阅相关文献[4，13-14]及大量试验，该研究建立了枯草菌肽的反相高效液相色谱（RP-HPLC）检测方法，可快速准确地检测枯草菌肽的含量及纯度。

1 材料与方法

1.1 材料

高效液相色谱仪（Agilent1260），购自安捷伦科技（中国）有限公司;色谱柱（ZORBAX 300SB-C 8，4.6 mm×150 mm，5 μm），购自安捷伦科技（中国）有限公司;乙腈（色谱级）、三氟乙酸（色谱级）、盐酸、氢氧化钠、过氧化氢均购自国药集团;枯草菌肽对照品（批号20141001，以干燥品计算，含量97.63%），由中农颖泰林州生物科园有限公司提供;枯草菌肽冻干粉原料3批（批号2016111601、2016112101、2016112601），由中农颖泰林州生物科园有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制。

1.2.1.1 供试品溶液。精密称量枯草菌肽冻干粉适量，用超纯水溶解稀释，再转移至10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，即得。

1.2.1.2 对照品溶液。

精密称量枯草菌肽对照品10.24 mg（相当于枯草菌肽10.00 mg），用超纯水溶解稀释，再转移至10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，即得1 mg/mL的对照品溶液。

1.2.2 枯草菌肽含量检测方法的建立。

1.2.2.1 色谱条件。用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以三氟乙酸-水（1∶1 000）为流动相A，以三氟乙酸-水-乙腈（0.85∶200∶800）为流动相B;柱温25 ℃，检测波长280 nm，流速1.0mL/min，进样量20 μL，按表1进行梯度洗脱。理论板数按枯草菌肽峰计算不低于2 000。

1.2.2.2 系统适用性试验。取“1.2.1.2”对照品溶液作为系统适用性溶液，依“1.2.2.1”色谱条件进行测定，对应理论板数、分离度、拖尾因子和峰面积4个参数分别连续进样5次。

1.2.2.3 方法专属性。考察枯草菌肽经过酸破坏、碱破坏、氧化破坏和热破坏处理后，主要破坏产物与枯草菌肽主峰的分离度，处理情况如下：①对照品，取“1.2.1.2”对照品溶液;②酸破坏，在对照品溶液中按1∶1比例加入0.1 mol/mL的盐酸溶液，室温酸破坏1 h; ③碱破坏，在对照品溶液中按1∶1比例加入0.05 mol/mL的氢氧化钠溶液，室温碱破坏15 min;④氧化破坏，在对照品溶液中按1∶1比例加入20%的过氧化氢溶液，室温氧化破坏1 h;⑤热破坏，取1 mL对照品溶液，水浴80 ℃加热15 min。

1.2.2.4 样品稳定性试验。

取供试品溶液，分别于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h 取样，依“1.2.2.1”色谱条件进行测定，

计算枯草菌肽主峰峰面积的RSD，考察枯草菌肽溶液在室温12 h内的降解情况。

1.2.2.5 方法学考察。

（1）灵敏度。采用逐步稀释的方法，按信噪比S/N≥3和S/N≥10计算检出限和定量限。

（2）重复性。取供试品，按“1.2.1.1”方法制备样品6份，依“1.2.2.1”色谱条件进行测定，计算枯草菌肽主峰保留时间和峰面积的RSD，考察重复性。

（3）中间精密度。取供试品，按“1.2.1.1”方法分2个实验员每人制备样品6份，依“1.2.2.1”色谱条件进行测定，计算枯草菌肽峰面积的RSD，考察中间精密度。

（4）准确度。按“1.2.1.2”方法配制0.8、1.0、1.2 mg/mL 3个不同浓度的对照品溶液作为准确度溶液，每个浓度的准确度溶液配制3份，每份样品测定2次，共测定18次，通过计算回收率考察准确度。

（5）线性关系。将枯草菌肽对照品制备成不同浓度的工作溶液，浓度分别为2.000 00、1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 mg/mL，依“1.2.2.1”色谱条件进行测定，记录色谱图。以浓度为横坐标、主峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程及相關系数。

（6）耐用性。取“1.2.1.2”对照品溶液作为耐用性溶液，改变柱温、流速和色谱柱批号，按“1.2.2.1”项下梯度洗脱程序进行检测，记录枯草菌肽理论塔板数、分离度大于1.5和相对保留时间（RRT）偏差绝对值，考察耐用性。

1.2.2.6 含量测定。取3批枯草菌肽冻干粉，按“1.2.1.1”方法制备样品，质量浓度为1 mg/mL，每批2份，取“1.2.1.2”对照品溶液作为对照溶液，按“1.2.2.1”色谱条件进行测定，记录色谱图，采用外标法[15]，以峰面积计算各样品的含量。

1.2.2.7 杂质测定。取3批枯草菌肽冻干粉，按“1.2.1.1”方法制备样品，每批2份，质量浓度为2 mg/mL，作为杂质测定用供试品溶液。各精密量取2 mL，分别置于100 mL容量瓶中，超纯水定容至刻度，摇匀，制得供试品溶液的2.0%浓度的溶液作为对照溶液。杂质测定用供试品溶液和对照溶液，按“1.2.2.1”色谱条件进行测定，每个样品测定3次，记录色谱图，供试品中主成分与杂质峰分离度大于1.5，主要杂质峰、总杂质峰及对照溶液峰面积RSD均小于5%，按不加校正因子的主成分自身对照法[15]计算杂质含量。

2 结果与分析

2.1 系统适用性 结果如表2所示，枯草菌肽理论板数为10 441，RSD为0.94%;分离度为2.99，RSD为0.49%;拖尾因子为2.13，RSD为2.11%;峰面积为1 891.1，RSD为0.09%，该方法系统适用性良好。

2.2 方法专属性 将枯草菌肽经过酸破坏、碱破坏、氧化破坏和热破坏处理后的溶液，按“1.2.2.1”色谱条件进行测定。结果表明（图1），该色谱条件下，枯草菌肽保留时间约9 min;空白对照不干扰枯草菌肽的含量测定。枯草菌肽在酸性降解条件和加热降解条件下比较稳定;在碱性降解条件下，主要在9.39 min出现含量约占11.5% 和在10.68 min出现含量约占31.9% 的2个较大破坏产物;在氧化降解中主要在8.7 min出现含量约占19.1% 和在9.2 min出现含量约占2.0% 的2个较大破坏产物;主要破坏产物和枯草菌肽主峰都可以有效地分开，说明该方法的专属性良好。

2.3 样品稳定性 按“1.2.2.4”方法操作，计算出枯草菌肽主峰峰面积的RSD为0.61%，主峰无明显降解。表明供试品溶液12 h内稳定。

2.4 方法学考察

2.4.1 灵敏度。采用逐步稀释法，取“1.2.1.2”对照品溶液，精密稀释制样，稀释至浓度为0.040、0.008、0.006、0.005、0.004、0.003 mg/mL，依“1.2.2.1”色谱条件进行测定。当枯草菌肽浓度为0.006 mg/mL，进样量20 μL，信噪比S/N约为10，定量限为120 ng;枯草菌肽浓度为0.004 mg/mL，进样量20 μL，信噪比S/N约为3，检出限为80 ng。

2.4.2 重复性。

按“1.2.2.5”中方法操作，计算出枯草菌肽主峰保留时间和峰面积的RSD分别为0.18%和 0.22%，表明重复性良好。

2.4.3 中间精密度。

按“1.2.2.5”中方法操作，计算出枯草菌肽峰面积的RSD为 0.92%，表明不同实验员间的中间精密度良好。

2.4.4 准确度。

以对照品溶液浓度为100%，配制80%、100%和120%浓度的准确度溶液。即按“1.2.2.5”中方法操作，按“1.2.2.1”色谱条件进行测定，色谱峰面积用标准曲线计算，得各溶液中枯草菌肽的量，求得平均回收率（n=9）为101.49%，RSD为 0.29%。结果见表3。

2.4.5 线性关系。按“1.2.2.5”中方法操作，以浓度为横坐标、主峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程为y=1 835.3x-16.146（R2=1），表明在0.031 25～2.000 00 mg/mL，枯草菌肽浓度与峰面积线性关系良好。

2.4.6 耐用性。

按“1.2.2.5”中方法操作，记录色谱图，结果显示（表4），枯草菌肽理论塔板数均大于2 000，分离度均大于1.5，相对保留时间（RRT）偏差绝对值均不大于20%，表明此方法耐用性良好。

2.5 含量测定 按“1.2.2.6”方法操作，结果见表5。3批枯草菌肽的平均含量分别为98.8%、99.8%和100.2%。

2.6 杂质测定 按“1.2.2.7”方法操作，结果见表6。3批枯草菌肽冻干粉原料单杂质均小于0.5%，总杂质均小于1.0%，纯度均大于99%。

3 讨论

3.1 流动相的选择 在枯草菌肽的纯化及相关试验过程中，发现该多肽易溶于水，而在反相色谱分离多肽和蛋白质的试验中，使用三氟乙酸作为离子对试剂是常见的手段，可以改善峰型、克服峰宽和拖尾问题[16-18]。故经过对流动相的配比进行反复摸索，选用以三氟乙酸-水（1∶1 000）为流动相A，以三氟乙酸-水-乙腈（0.85∶200∶800）为流动相B能够满足对枯草菌肽含量和纯度的分析。

3.2 检测波长的选择 将枯草菌肽溶解在超纯水中，按照紫外-可见分光光度法（《中华人民共和国兽药典》2015年版一部通则0401）[15]测定，在280 nm波长处有最大吸收。

3.3 杂质测定 枯草菌肽为枯草芽孢杆菌发酵产物，在反相色谱中无法明确每一微量杂质具体为何种物质，故而无法获得各杂质的校正因子，因此在用反相高效液相色谱法测定杂质含量时，使用《中华人民共和国兽药典》2015年版一部通则0512）[15]色谱法中的不加校正因子的主成分自身对照法，计算杂质含量。

3.4 对照品的标定 该研究所用的枯草菌肽对照品为中农颖泰林州生物科園有限公司自行制备，目前国内外也尚无同类标准品。依据《9901国家药品标准物质制备指导原则》（《中国药典》2015版第四部，通则）[19]，枯草菌肽对照品的赋值采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）和全柱成像毛细管等电聚焦电泳法（WCID-cIEF）2种不同的原理检测纯度，再依据质量平衡法，分别计算含量。质量平衡法计算枯草菌肽对照品含量的公式：①以干燥品计算，对照品含量（%）=〔100%-炽灼残渣（%）〕×纯度（%）;②以湿品计算，对照品含量（%）=〔100%-干燥失重（%）-炽灼残渣（%）〕×纯度（%）。

4 结论

该研究建立的反相高效液相色谱定量检测枯草菌肽的方法，准确度好，精密度高，重复性稳定，可用于枯草菌肽的纯度分析和定量检测，并为完善及提高枯草菌肽原料及相关产品的质量标准提供了一定的实践基础和科学依据。

参考文献

[1]

丁修良，赵建飞，王帅，等.抗菌肽Sublancin对肉鸡生长性能、养分利用及盲肠菌群的影响[J].动物营养学报，2018，30（7）：2690-2699.

[2] 檀磊.抗菌肽作为饲料添加剂的研究[J].生物化工，2019，5（2）：163-166.

[3] 田丽娜，王秀荣，李广兴.抗菌肽Sublancin对蛋鸡免疫功能的影响研究[J].中国预防兽医学报，2020，42（2）：268-273.

[4] PAIK S H，CHAKICHERLA A，HANSEN J N.Identification and characterization of the structural and transporter genes for，and the chemical and biological properties of，sublancin 168，a novel lantibiotic produced by Bacillus subtilis 168[J].Journal of biological chemistry，1998，273（36）： 23134-23142.

[5] GARCIA DE GONZALO C V，ZHU L Y，OMAN T J，et al.NMR structure of the S-linked glycopeptide sublancin 168[J].ACS chemical biology，2014，9（3）：796-801.

[6] 尚丽君，杨天任，于海涛，等.抗菌肽Sublancin与黄芪多糖对免疫抑制小鼠免疫功能调节作用的比较分析[J].畜牧兽医学报，2019，50（2）：406-414.

[7] 杨天任，王帅，黄烁，等.抗菌肽Sublancin与黄芪多糖对小鼠免疫调节作用的比较研究[J].动物营养学报，2018，30（6）：2337-2345.

[8] 张晓雅，杨青，王帅，等.抗菌肽Sublancin增强小鼠获得性免疫的研究[J].动物营养学报，2018，30（1）：236-245.

[9] WANG S，YE Q H，WANG K，et al.Enhancement of macrophage function by the antimicrobial peptide sublancin protects mice from methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].Journal of immunology research，2019，2019：1-47.

[10] WANG S，HUANG S，YE Q H，et al.Prevention of cyclophosphamide-induced immunosuppression in mice with the antimicrobial peptide sublancin[J].Journal of immunology research，2018，2018：1-11.

[11] LIU Y K，ZHANG Y，WANG S，et al.A novel adjuvant "sublancin" enhances immune response in specific pathogen-free broiler chickens inoculated with Newcastle disease vaccine[J].Journal of immunology research，2019，2019：1-7.

[12] 楊琼，刘进远，张代芬.抗菌肽在生猪养殖中的应用[J].安徽农业科学，2019，47（15）：1-4.

[13] OMAN T J，BOETTCHER J M，WANG H，et al.Sublancin is not a lantibiotic but an S-linked glycopeptide[J].Nature chemical biology，2011，7（2）：78-80.

[14] STEPPER J，SHASTRI S，LOO T S，et al.Cysteine S-glycosylation，a new post-translational modification found in glycopeptide bacteriocins[J].FEBS letters，2011，585（4）：645-650.

[15] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典（一部）[S].北京：中国农业出版社，2015：附录37-39，69-70.

[16] APFFEL A，FISCHER S，GOLDBERG G，et al.Enhanced sensitivity for peptide mapping with electrospray liquid chromatography-mass spectrometry in the presence of signal suppression due to trifluoroacetic acid-containing mobile phases[J].Journal of chromatography A，1995，712（1）：177-190.

[17] CHEN Y，MEHOK A R，MANT C T，et al.Optimum concentration of trifluoroacetic acid for reversed-phase liquid chromatography of peptides revisited[J].Journal of chromatography A，2004，1043（1）： 9-18.

[18] MAO Y，KLEINBERG A，ZHAO Y L，et al.Simple addition of glycine in trifluoroacetic acid-containing mobile phases enhances the sensitivity of electrospray ionization mass spectrometry for biopharmaceutical characterization [J].Analytical chemistry，2020，92（13）： 8691-8696.

[19] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版 四部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：416-417.