安石榴苷对阿霉素所致心脏毒性的改善作用及其可能机制▲

安慧仙 孙 闯 李 炜 康晓军 方 东 高 钊 王 瑞 曾广伟

(西安国际医学中心医院心血管内科，陕西省西安市 710100)

阿霉素是临床广泛使用的一线抗癌药物，在淋巴血液系统恶性肿瘤(如淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和白血病等)和实体器官恶性肿瘤(如甲状腺癌、乳腺癌、骨肉瘤、肉瘤等)中均有较好的治疗效果，但剂量依赖性的心脏毒性限制了阿霉素的临床应用[1-3]。目前，阿霉素导致心脏毒性的机制尚未完全阐明，已知的机制主要包括活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)增加、拓扑异构酶介导的DNA修复受阻、线粒体结构破坏等[4-5]。

安石榴苷是石榴皮多酚的主要活性物质，具有多种药理学特性，包括抗炎、抗病毒、抗氧化作用等[6-7]。以往的研究已经证实，安石榴苷可改善多种疾病的症状，如阿尔兹海默症、肿瘤和心血管疾病等[8-9]。还有研究表明，安石榴苷可通过抗氧化作用减轻脑缺血再灌注损伤和心脏缺血再灌注损伤[10-11]。然而安石榴苷是否可以改善阿霉素诱发的心脏毒性，其相关机制如何，目前尚未清楚。因此，本研究通过建立阿霉素诱发的心脏毒性小鼠模型，探讨安石榴苷能否通过调控5′-单磷酸腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate activated protein kinase,AMPK)/核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)通路改善阿霉素诱发的心脏毒性。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂 48只8周龄成年雄性C57BL/6小鼠购于西安交通大学实验动物中心[动物生产许可证：SCXK(陕)2018-001]，体质量25～30 g。将小鼠饲养于温度为(25±1)℃，相对湿度为(55±5)%，12 h/12 h明暗交替的动物房。阿霉素(批号：D1515)、安石榴苷(批号：P0023)和Compound c(一种AMPK抑制剂；批号：171260)购于Sigma-Aldrich Lab & Production Materials公司；二氢乙啶(dihydroethidium，DHE)染色试剂盒(批号：E004-1-1)和肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT；批号：H149-4)试剂盒购于南京建成生物工程研究所有限公司；cleaved Caspase-3(批号：9661)、细胞色素c(cytochrome c，Cyt-c；批号：11940)、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK,p-AMPK；批号：2537)、AMPK(批号：5832)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2；批号：13141)、Nrf2(批号：12721)和血红素加氧酶 1(heme oxygenase 1，HO-1；批号：82206)抗体均购于Cell Signaling Technology公司；gp91phox(还原型辅酶Ⅱ氧化酶2的亚基；批号：19013-1-AP)抗体购买于武汉三鹰生物技术有限公司；GAPDH抗体(批号：TA-08)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗(批号：ZB-5305)和山羊抗兔抗体(批号：ZB-2301)购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验分组和动物模型的建立 48只C57BL/6小鼠在动物房内适应性喂养3 d后用于实验。将小鼠按随机数字表法分为对照组、阿霉素组、阿霉素+安石榴苷组、阿霉素+安石榴苷+Compound c组，每组12只。除对照组外，给予其他各组小鼠一次性腹腔注射阿霉素(15 mg/kg)。同时，给予阿霉素+安石榴苷组小鼠腹腔注射安石榴苷(30 mg/kg，1次/d)，给予阿霉素+安石榴苷+Compound c组小鼠腹腔注射安石榴苷(30 mg/kg，1次/d)后再腹腔注射Compound c(0.25 mg/kg，1次/d)，均连续干预7 d。实验干预期间给予对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水。本实验模型建立的方法和药物注射浓度均参照相关文献[11-13]。

1.3 观察指标

1.3.1 心脏功能：干预7 d后，用4 %水合氯醛麻醉小鼠后将其固定在恒温手术台上，在体视显微镜下辨别、分离颈动脉，于颈动脉远端穿线结扎，在颈动脉近端做一切口，将连有压力传感器的动脉套管针沿切口经颈动脉插入左心室，采用多道生理记录仪[埃德仪器国际贸易(上海)有限公司，型号：Labchart 8]测量左室压力上升最大速率(+dp/dtmax)和左室压力下降最大速率(-dp/dtmax)，以评估各组小鼠心脏的收缩和舒张功能。

1.3.2 心脏组织形态结构：检测心脏功能后，行颈动脉血管分离术并于剪口取血1 mL；4 ℃下3 000 r/min离心10 min，获取上清液，并冻存于-80 ℃冰箱中备用。然后开胸分离心脏，用预冷的PBS冲洗以去除血液，然后将部分心脏组织放入4 %多聚甲醛中室温固定48 h；常规石蜡包埋、制作切片；将石蜡切片在二甲苯和梯度酒精中脱蜡复水后，再行HE染色，中性树胶封片。在光学显微镜下观察各组小鼠的心脏组织形态结构。

1.3.3 血清cTnT水平：取1.3.2的上清液，严格按照试剂盒说明书，采用ELISA检测，于酶标仪上检测450 nm波长处各组吸光度值，然后根据说明书的公式计算出各组小鼠血清cTnT水平。

1.3.4 心脏组织ROS水平：采用DHE染色方法检测ROS水平。取1.3.2经预冷PBS冲洗后的部分心脏组织，用冰冻切片包埋剂快速包埋后制作切片。用PBS将DHE原液按1 ∶1 000配制成工作液，避光37 ℃孵育30 min，然后用PBS漂洗3次，用激光共聚焦显微镜扫描拍照，再用Image-Pro Plus软件测定荧光强度。

1.3.5 cleaved Caspase-3、Cyt-c、gp91phox、SOD2、p-AMPK、AMPK、Nrf2和HO-1蛋白表达水平：按1.3.2的方法获取心脏组织后，称取各组小鼠心脏组织50 mg，加入含有蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和RIPA的裂解混合液，低温下研磨20 min，4 ℃下15 000 r/min离心30 min，取上清液，采用BCA法对蛋白进行定量；上样蛋白后进行SDS-PAGE、转PVDF膜，采用5 %脱脂奶粉封膜2 h，将目的蛋白条带放入含相应抗体的管中，包括cleaved Caspase-3、Cyt-c、gp91phox、SOD2、p-AMPK、AMPK、Nrf2、HO-1，稀释比均为1 ∶1 000，以GAPDH为内参蛋白，稀释比为1 ∶5 000，于4 ℃下孵育12 h；采用TBST快速洗膜3次，10 min/次，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗鼠二抗(1 ∶5 000)孵育膜2 h，TBST快速洗膜3次，10 min/次；于Bio-Rad化学发光仪上显影，用Image Lab软件分析蛋白条带灰度值。

1.4 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组小鼠心脏功能和血清cTnT水平的比较 与对照组比较，阿霉素组小鼠的+dp/dtmax和-dp/dtmax降低，血清cTnT水平升高(均P<0.05)；与阿霉素组比较，阿霉素+安石榴苷组小鼠的+dp/dtmax和-dp/dtmax增加，血清cTnT水平降低(均P<0.05)；与阿霉素+安石榴苷组比较，阿霉素+安石榴苷+Compound c组小鼠的+dp/dtmax和-dp/dtmax降低，血清cTnT水平升高(均P<0.05)。见表1。

表1 4组小鼠心脏功能和血清cTnT水平的比较(x±s)

2.2 4组小鼠心脏形态结构的比较 HE染色结果显示，对照组小鼠心肌纤维排列整齐，胞质无空泡化现象；阿霉素组小鼠心肌纤维排列不整齐，出现明显的胞质空泡化；阿霉素+安石榴苷组小鼠心肌纤维排列较为整齐，胞质空泡化现象明显减少；与阿霉素+安石榴苷组比较，阿霉素+安石榴苷+Compound c组小鼠心肌纤维排列不整齐，胞质空泡化现象明显。见图1。

图1 各组小鼠心脏组织形态结构(HE染色，×200)

2.3 4组小鼠心脏组织凋亡蛋白表达水平的比较 与对照组相比，阿霉素组和阿霉素+安石榴苷+Compound c组小鼠的cleaved Caspase-3和Cyt-c的蛋白表达水平升高(均P<0.05)；与阿霉素组比较，阿霉素+安石榴苷组小鼠的cleaved Caspase-3和Cyt-c的蛋白表达水平降低(均P<0.05)；与阿霉素+安石榴苷组比较，阿霉素+安石榴苷+Compound c组小鼠的cleaved Caspase-3和Cyt-c的蛋白表达水平升高(均P<0.05)。见图2和表2。

图2 各组小鼠cleaved Caspase-3和Cyt-c的蛋白表达情况

表2 各组小鼠心肌细胞凋亡蛋白相对表达水平的比较(x±s)

2.4 4组小鼠心脏组织氧化应激水平的比较 DHE染色和Western blot结果显示，与对照组比较，阿霉素组和阿霉素+安石榴苷+Compound c组小鼠的ROS水平和gp91phox蛋白表达水平升高，SOD2蛋白表达水平降低(均P<0.05)；与阿霉素组比较，阿霉素+安石榴苷组小鼠的ROS水平和gp91phox蛋白表达水平降低，SOD2蛋白表达水平升高(均P<0.05)；与阿霉素+安石榴苷组比较，阿霉素+安石榴苷+Compound c组小鼠的ROS水平和gp91phox蛋白表达水平升高，SOD2蛋白表达水平降低(均P<0.05)。见图3、图4和表3。

图3 4组小鼠心脏组织DHE染色结果(×200)

图4 4组小鼠心脏组织氧化应激蛋白表达情况

表3 4组小鼠心脏组织氧化应激指标水平的比较(x±s)

2.5 各组小鼠心脏组织AMPK/Nrf2通路相关蛋白表达水平的比较 与对照组比较，阿霉素组和阿霉素+安石榴苷+Compound c组小鼠的p-AMPK、Nrf2和HO-1蛋白表达水平降低(均P<0.05)；与阿霉素组比较，阿霉素+安石榴苷组小鼠的p-AMPK、Nrf2和HO-1蛋白表达水平升高(均P<0.05)；与阿霉素+安石榴苷组比较，阿霉素+安石榴苷+Compound c组小鼠的p-AMPK、Nrf2和HO-1蛋白表达水平降低(均P<0.05)。4组小鼠AMPK蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图5和表4。

图5 各组小鼠心脏组织p-AMPK、AMPK、Nrf2和HO-1蛋白表达情况

表4 4组小鼠心脏组织p-AMPK、AMPK、Nrf2和HO-1蛋白相对表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

随着恶性肿瘤筛查和治疗技术的进步，恶性肿瘤患者的预后得到了显著改善，蒽环类化疗药物在多种恶性肿瘤的治疗中发挥重要作用。然而，在接受蒽环类药物(如阿霉素)治疗的成年恶性肿瘤患者中，约有9%的患者会出现心脏毒性，并呈剂量和时间依赖性[14]，这可导致患者的预后不佳，并使得恶性肿瘤幸存者心血管疾病患病率和病死率升高。尽管有关蒽环类药物心脏毒性机制的研究已开展50年，但具体机制还未完全阐明。

安石榴苷是我国传统中药材石榴皮的重要活性成分之一，在线粒体代谢、氧化应激和炎症反应中发挥重要作用，已经成为临床上治疗多种疾病的潜在选择。例如，有研究表明，安石榴苷可通过减轻氧化应激和减少细胞凋亡，改善人胎盘滋养层细胞损伤[15]；安石榴苷还可通过抑制心肌细胞凋亡，减轻缺血/再灌注诱导的心肌损伤[11]。但安石榴苷在阿霉素引起的心脏毒性中的作用如何，目前研究报告较少，具体机制还未完全阐明。本研究建立阿霉素诱发的心脏毒性小鼠模型，并给予安石榴苷干预，分析安石榴苷改善阿霉素所致心脏毒性的作用及机制。

cTnT是评估急性冠脉综合征患者病情的重要指标，而在采用蒽环类药物化疗的不同类型癌症患者中，有21%～40%的患者出现cTnT持续升高，因此cTnT也可作为识别抗肿瘤药物所致心脏毒性的早期生物学标志物[16]。此外，蒽环类药物还可导致心脏功能障碍和心肌纤维损伤[15]。本研究结果显示，与对照组比较，阿霉素组小鼠的+dp/dtmax和-dp/dtmax降低，血清cTnT水平升高(均P<0.05)，心肌细胞胞质呈严重空泡化，这提示阿霉素对小鼠产生严重的心脏毒性；而给予安石榴苷干预后小鼠的+dp/dtmax和-dp/dtmax升高，血清cTnT水平降低(均P<0.05)，心肌细胞胞质空泡化减轻，提示安石榴苷可以改善阿霉素所致的心脏毒性。与阿霉素+安石榴苷组比较，阿霉素+安石榴苷+Compound c组的小鼠+dp/dtmax和-dp/dtmax降低，血清cTnT水平升高(均P<0.05)，说明AMPK抑制剂Compound c能逆转安石榴苷对阿霉素所致心脏毒性的保护作用。

细胞凋亡和氧化应激损伤是阿霉素引起心脏毒性的主要原因之一[2]。当线粒体膜通透性增加，促凋亡因子Cyt-c由线粒体释放到胞质并与凋亡蛋白酶激活因子结合形成凋亡复合体，将Caspase-3剪切成cleaved Caspase-3，启动Caspase级联反应，这是细胞凋亡的主要途径[17]。氧化因子ROS、gp91phox和抗氧化因子SOD2失衡是机体出现氧化应激的主要原因[18]。有研究显示，安石榴苷具有较强的抗凋亡、清除自由基和抗脂质过氧化能力[15]。本研究结果显示，与对照组比较，阿霉素组ROS水平及cleaved Caspase-3、Cyt-c、gp91phox蛋白表达水平升高，SOD2蛋白表达水平降低(均P<0.05)，说明阿霉素可增强心肌细胞凋亡和氧化应激损伤；而给予安石榴苷干预后，小鼠的ROS水平及cleaved Caspase-3、Cyt-c、gp91phox蛋白表达水平降低，SOD2蛋白表达水平升高(均P<0.05)，说明安石榴苷可以减轻阿霉素所致心肌细胞凋亡和氧化应激损伤。但与阿霉素+安石榴苷组比较，阿霉素+安石榴苷+Compound c组小鼠ROS水平及cleaved Caspase-3、Cyt-c、gp91phox蛋白表达水平升高，SOD2蛋白表达水平降低(均P<0.05)，提示Compound c能逆转安石榴苷对阿霉素所致心肌细胞凋亡和氧化应激损伤的改善作用。

AMPK是心肌细胞中调控能量代谢的重要信号分子，Nrf2和HO-1是调控氧化应激损伤的重要信号。细胞能量生成不足可导致单磷酸腺苷/三磷酸腺苷比值增加，AMPK发生磷酸化并被激活，从而促进下游多种靶蛋白参与细胞能量代谢、调控线粒体功能和细胞凋亡等过程[11]。机体出现心脏毒性时，p-AMPK、Nrf2和HO-1表达水平降低，导致线粒体能量代谢障碍、氧化应激增强及细胞凋亡增加[19]。本研究结果显示，4组小鼠心脏组织中AMPK蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，但阿霉素组小鼠心脏组织中的p-AMPK、Nrf2和HO-1蛋白表达水平较对照组降低，而阿霉素+安石榴苷组p-AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白表达水平较阿霉素组增加(均P<0.05)，这提示安石榴苷可通过调控AMPK/Nrf2通路，减轻阿霉素引起的小鼠心脏毒性。给予Compound c干预后，其可逆转安石榴苷对p-AMPK、Nrf2和HO-1表达的调控作用。

综上所述，阿霉素具有心脏毒性，安石榴苷可能通过调控AMPK/Nrf2通路抑制细胞凋亡和减轻氧化应激损伤，从而改善阿霉素引起的心脏毒性。这或为采用安石榴苷防治阿霉素引起的心脏毒性提供了新思路。