黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8次生代谢产物研究

2022-02-18尤梦瑶闫佳佳郑春英

黑龙江大学自然科学学报 2022年6期

尤梦瑶, 闫佳佳, 万璐, 吴桐, 郑春英

(1.黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心, 哈尔滨 150080;2.黑龙江大学生命科学学院黑龙江省普通高等学校微生物重点实验室, 哈尔滨 150080;3.黑龙江大学生命科学学院黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室, 哈尔滨 150080)

0 引言

黄芪为豆科植物蒙古黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.Mongholicus (Bge.) Hsiao)或膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.)的干燥根[1]，含有黄酮类、皂苷类和多糖等多种活性成分[2]，具有抗肿瘤、抗衰老、免疫调节、抗病毒性心肌炎和降血糖等作用[3]，是既食又药的功能性保健食品[4]，深受人们喜爱。

近年来，对黄芪内生菌的研究报道[5-6]越来越多，但是这些报道大多局限在对黄芪内生菌的分离和鉴定方面，对其次生代谢产物的系统研究鲜有报道。本文选取分离自黄芪根部的内生枯草芽孢杆菌HS8(Baci-llussubtilis)为研究对象，作为典型工业模式微生物[7]，枯草芽孢杆菌 (B.subtilis)是中国农业部和美国食品药物管理局(FDA)认定的安全菌株[8-9]，含有内酯类、多肽、萜类、异香豆素类、生物碱类和有机酸[10]等活性物质，具有抗肿瘤[11]、抗菌[12]、抗炎[13]和抗溃疡[14]等活性作用，在药品生产[15]和食品发酵[16]等方面被广泛应用。本文对黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8(B.subtilis)发酵液中的次生代谢产物进行了系统研究，旨在深入开发利用该菌株，为其次生代谢产物的获取及工业化生产奠定基础。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

1.1.1仪器与试剂

高效液相色谱仪(FL2200，浙江温岭福立分析仪器有限公司)；超声波清洗器(KQ-100DE，昆山市超声仪器有限公司)。

乙腈和甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.1.2供试菌

内生细菌HS8分离自黑龙江省大兴安岭地区野生黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)根，委托上海生工生物工程股份有限公司鉴定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，现保藏于黑龙江大学生命科学学院生物制药专业实验室。

1.1.3培养基

营养琼脂(Nutrient agar, NA)和营养肉汤(Nutrient broth, NB)培养基：见文献[17]。

1.2 实验方法

1.2.1黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8的抗菌活性分析

(1) 发酵液的制备

将内生枯草芽孢杆菌HS8接种于NA培养基，恒温活化培养(37 ℃，3 d)，取活化后的内生枯草芽孢杆菌HS8，制备1×107CFU·mL-1的种子液(制备方法：在无菌条件下接种于60 mL的NB培养基中，37 ℃，120 r·min-1，3 d)；以5%接种量将内生枯草芽孢杆菌HS8的种子液接种到300 mL的NB培养基中，恒温培养(37 ℃，120 r·min-1，5 d)，过滤，即得发酵液。

(2) 黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8的抗菌活性分析

取发酵液，减压浓缩至100 mL，采用乙酸乙酯萃取(3×100 mL)，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，冻干。取冻干粉5 mg，以10 mL甲醇溶解，作为浓度为500 μg·mL-1的供试品液；以链霉素溶液和制霉菌素溶液(0.1 mg·mL-1)作为阳性对照，甲醇溶液作为溶剂对照。参阅文献[18]，采用琼脂扩散法对内生枯草芽孢杆菌HS8发酵液进行抗菌活性的测定。

1.2.2黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8的次生代谢物分析

(1) 液相色谱条件

Venusil XBP-C18柱(φ4.6 mm×250 mm，5 μm，USA)；流动相①：甲醇-水-冰醋酸(50∶49.7∶0.3)；流动相②：甲醇-水-冰醋酸(30∶69.5∶0.5)；流动相③：乙腈-水(92.5:7.5)；流动相④：甲醇-水(50∶50)；流速：1 mL·min-1；柱温：25 ℃；检测波长：254 nm；进样量：10 μL。

(2) 对照品及对照药材液的制备

分别精确称取适量的原儿茶酸、阿魏酸和β-谷甾醇对照品，加入色谱级甲醇，分别制成0.2 mg·mL-1的对照品溶液；分别称取黄芪根和黄芪茎干粉各10 g，加入100 mL甲醇，超声提取1 h，过滤后于50 ℃减压浓缩至10 mL，即得黄芪对照药材液。

(3) 供试品液的制备

采用1.2.1的方法制备发酵液，依次采用氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇进行萃取(3×100 mL)，合并萃取液，低温浓缩后，分别溶于10 mL色谱级甲醇，即得内生枯草芽孢杆菌HS8发酵液氯仿萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、水饱和正丁醇萃取部位。

取10 L HS8发酵液缓慢通过D101大孔树脂柱(控制流速)，采用乙醇梯度洗脱(乙醇体积分数分别为：30%、50%、70%和90%)，收集不同洗脱馏分，对不同洗脱馏分进行活性成分分析。

1.2.3黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8次生代谢产物分离

根据分析结果进行有目的的分离。

选取1.2.2(3)中30%乙醇洗脱部位进行聚酰胺柱分离，采用氯仿∶甲醇(10∶1)洗脱，收集洗脱液(10 mL/组分)，随行TLC检测跟踪，合并20～70号组分，回收溶剂，进行硅胶柱色谱分离，采用氯仿∶甲醇(2∶1)洗脱，收集洗脱液(10 mL/组分)，随行TLC检测跟踪，合并100～127号组分，回收溶剂，重结晶，得化合物A。

选取1.2.2(3)中90%乙醇洗脱部位进行聚酰胺柱分离，依然采用乙醇梯度洗脱，随行TLC检测跟踪，取90%乙醇洗脱部位浓缩近干后进行硅胶柱分离，以石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)洗脱，收集洗脱液(10 mL/组分)，随行TLC检测跟踪，合并25～36号组分，回收溶剂，重结晶，得化合物B。

选取1.2.2(3)中乙酸乙酯萃取部位进行硅胶柱分离，以石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)进行洗脱，收集洗脱液(10 mL/组分)，随行TLC检测跟踪，合并125～190号组分，回收溶剂后进行硅胶柱色谱纯化，采用石油醚：乙酸乙酯(1∶2)洗脱，收集洗脱液(10 mL/组分)，随行TLC检测跟踪，合并17～30号组分，重结晶，得化合物C。

2 结果分析

2.1 黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8的抗菌活性分析

对黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8发酵液进行抑菌活性筛选，结果如表1所示。由表1可知，黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8发酵液对11种供试细菌以及供试真菌均有不同程度的抑制作用，阴性对照的甲醇无干扰，且抑菌谱广，尤其对肺炎克雷伯菌、铜绿假单孢菌和短小芽孢杆菌的抑制效果最为显著，抑菌圈直径分别达到(20.8±0.1)、(20.7±0.3)和(20.5±0.1) mm，对粪肠球菌的抑制效果也较为明显，抑菌圈直径达到(19.3±0.1) mm。上述结果表明，黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8发酵液具有较好的抗菌活性，可应用于抗菌剂的开发。

表1 HS8发酵液抗菌活性结果(mm)

对黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8发酵液的水饱和正丁醇、乙酸乙酯以及氯仿萃取部位中的次生代谢产物进行分析，结果如图1所示。由图1可知，黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8发酵液的水饱和正丁醇、乙酸乙酯以及氯仿萃取部位中均含有多种次生代谢产物，其中，乙酸乙酯萃取部位含有的活性成分较多；以黄芪茎和根生药为对照，内生枯草芽孢杆菌HS8的乙酸乙酯萃取部位在保留时间为10 min和17 min时出现与黄芪生药相同的色谱峰。因此，选取黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8发酵液的乙酸乙酯萃取部位进行次生代谢产物的分离。

2.2 黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8的次生代谢产物分析

注： A：黄芪根样品；B：黄芪茎样品；C：NB空白对照；D：HS8水饱和正丁醇萃取部位；E：HS8乙酸乙酯萃取部位；F：HS8氯仿萃取部位图1 黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8不同萃取部位次生代谢产物分析Fig.1 Analysis of secondary metabolites in different extracted parts of endophytic Bacillus subtilis HS8

对1.2.2(3)中的30%乙醇洗脱部位采用1.2.2(1)中流动相②进行次生代谢产物分析，结果如图2所示，对1.2.2(3)中90%乙醇洗脱部位1.2.2(1)中流动相③进行次生代谢产物分析，结果如图3所示。由图2可以看出，30%乙醇洗脱部位中在与原儿茶酸对照品相同的保留时间内出现相同的色谱峰。由图3可以看出，90%乙醇洗脱部位在与β-谷甾醇对照品相同的保留时间内出现相同的色谱峰，并且空白培养基无干扰。说明在30%乙醇洗脱部位及90%乙醇洗脱部位中分别含有原儿茶酸及β-谷甾醇，可以针对这些活性部位有目的的进行分离纯化。此外，对1.2.2(3)中50%及70%乙醇洗脱部位中次生代谢产物进行了分析，尚未检测到已知化合物。

注：A：原儿茶酸对照品；B：D101大孔树脂柱30%乙醇洗脱部位；C：NB空白对照

elution fraction 注：A：β-谷甾醇对照品；B：D101大孔树脂柱90%乙醇洗脱部位；C：NB空白对照

2.3 黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8次生代谢产物分离

从黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8中分离得到3个化合物。

化合物A：白色针状结晶，易溶解于甲醇、乙醇和氯仿等有机溶剂。以原儿茶酸为对照品，选用1.2.2(1)中流动相②，采用标准加入法对化合物A进行HPLC分析，并对其纯度进行测定，结果如图4和图5所示。由图可知，化合物A为纯度较高的单一化合物，纯度为99.48%，与原儿茶酸对照品混合后出现单一色谱峰，说明化合物A可能为原儿茶酸，因此采用1H-NMR对其结构进行确认。

图4 化合物A的高效液相色谱图

图5 化合物A与原儿茶酸混合的高效液相色谱图

化合物A的1H-NMR鉴定结果：1H-NMR(400 MHz，MeOD)：δ7.43(1H，s，H-2)，7.41(1H，d，J=1.9 Hz，H-6)，6.83(2H，dd，J=8.0 Hz，H-5)，苯环上有3个取代基，上述数据与文献[19]报道的原儿茶酸一致，综合TLC、HPLC和1H-NMR分析结果，确定化合物A为原儿茶酸。

化合物B：白色结晶，难溶解于甲醇，易溶于氯仿。以β-谷甾醇为对照，选用1.2.2(1)中流动相③，采用标准加入法对化合物B进行HPLC分析，并对其纯度进行测定，结果如图6和图7所示。由图可知，化合物B为纯度较高的单一化合物，纯度为98.21%，与β-谷甾醇对照品混合后出现单一色谱峰，说明化合物B可能为β-谷甾醇，因此采用1H-NMR对其结构进行确认。

图6 化合物B的高效液相色谱图

图7 化合物B与β-谷甾醇混合的高效液相色谱图

化合物B的1H-NMR鉴定结果：1H NMR (400 MHz，MeOD):δ5.34 (1H，s，H-6 )，1.02 (2H，s，H-19 )，0.95 (2H，d，J=6.4 Hz，H-21)，0.86 (3H，dd，J=15.5，7.8 Hz，H-26)，0.72 (1H，s，H-18)，以上数据与文献[20]报道的β-谷甾醇一致，综合TLC、HPLC和1H-NMR分析结果，确定化合物B为β-谷甾醇。

化合物C：透明针状结晶，微溶于氯仿，易溶于甲醇等有机溶剂。以阿魏酸为对照，选用1.2.2(1)中流动相④，采用标准加入法对化合物C进行HPLC分析，并对其纯度进行测定，结果如图8和图9所示。由图可知，化合物C为纯度较高的单一化合物，纯度为98.57%，与阿魏酸对照品混合后出现单一色谱峰，说明化合物C可能为阿魏酸，因此采用1H-NMR对其结构进行确认。

图8 化合物C的高效液相色谱图

图9 化合物C与阿魏酸混合的高效液相色谱图

化合物C的1H-NMR鉴定结果：1H-NMR (400 MHz，MeOD)：δ7.59 (1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，7.18 (1H，d，J=1.7 Hz，H-2)，7.06 (1H，dd，J=8.2，1.8 Hz，H-6)，6.81 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.31 (1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，3.89 (s，3-OCH3)。由1H-NMR数据分析可得，化合物C中存在反式烯烃，苯环为1′，3′，4′取代，4′取代基为—OCH3。以上数据与文献[21]报道的阿魏酸一致，综合TLC、HPLC和1H-NMR分析结果，确定化合物C为阿魏酸。

化合物A～C结构如图10所示。

图10 化合物A～C的结构

3 讨论

众所周知，植物内生菌次生代谢产物丰富，是新型次生代谢产物资源[22]。通常，内生菌次生代谢产物含量较低，这为其研究带来很大困难。为了避免分离的盲目性，基于植物内生菌能够产生与宿主植物相同或相似的活性成分的理论，选取抑菌活性较好的黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8为研究对象，采用HPLC法对其发酵液中可能存在的次生代谢产物进行分析，并与黄芪生药进行对比分析。在分析结果的基础上，有针对性地设计次生代谢产物分离工艺，分离得到3个具有较好抗菌活性、且与宿主植物黄芪相同的次生代谢产物。其中化合物A为原儿茶酸，该化合物是一种在植物界中分布广泛的天然酚酸，具有抗菌、抗氧化和抗肿瘤等活性作用[23]，同时，该化合物也是川芎嗪等合成药物的前体物质[24]；化合物B是β-谷甾醇，β-谷甾醇是一种常见的植物固醇类化合物[25]，在抗炎、抗癌和降血糖等方面均表现出优异的生物活性[26]；化合物C为阿魏酸，阿魏酸是一种广泛存在于植物中的有机酸，具有抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、抗氧化、抗菌消炎和抗紫外线辐射等作用[27]，因其几乎没有毒副作用，所以具有较高的药用价值[28]。

尽管已从枯草芽孢杆菌发酵液中分离出多种次生代谢产物，但从枯草芽孢杆菌中分离、纯化原儿茶酸(A)、β-谷甾醇(B)及阿魏酸(C)的研究未见报道。上述研究丰富了枯草芽孢杆菌次生代谢产物库，为发现先导化合物奠定了基础。因此，内生枯草芽孢杆菌HS8是一株具有深入开发应用价值的内生枯草芽孢杆菌。此外，在内生枯草芽孢杆菌HS8次生代谢产物的分离过程中，也分离得到了多种其他化合物，但得率较低，不能进行结构鉴定。后续将针对黄芪内生枯草芽孢杆菌HS8次生代谢产物分离过程中存在的各种问题进行相应的研究，为提高内生枯草芽孢杆菌HS8次生代谢产物产量及工业化生产奠定基础。